Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 03/05/2022
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-511922)
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nouveau-nées, une partie est exposée huit jours à une hypoxie sévère (10 % d’oxygène, équivalent à 4 500 mètres) pour reproduire la grande prématurité, reçoit une injection de 4-hydroxytamoxifène, puis à l’âge adulte une implantation d’électrodes cérébrales et une privation de sommeil paradoxal de 48 heures, avant mise à mort et analyse du cerveau. Le porteur indique que la chirurgie a un effet négatif modéré et peut provoquer des irritations autour de l’implant. Il affirme que l’analyse in vivo reste « incontournable » et que la souris est « nécessaire » faute de modèle reproductible in vitro.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La période postnatale correspond à la période critique au cours de laquelle l’environnement façonnent et affinent les neurones contrôlant nos comportements et notre cognition. Des perturbations induites durant cette période peuvent avoir des conséquences dramatiques et persistantes sur le fonctionnement du cerveau. Cette situation se retrouve chez les bébés en prématurité. Il est possible de reproduire la plupart des déficits observés chez les bébés grand-prématurés à travers un modèle rongeur classique dit d’hypoxie chronique. Des études récentes suggèrent une perturbation des réseaux de neurones dans ce modèle animal, qui sont profondes et persistantes. Il est probable que ces perturbations soient responsables de déficits cognitifs variés, incluant des troubles du sommeil. Dans ce contexte, notre projet vise à évaluer la perturbation du sommeil dans un modèle souris d’hypoxie chronique, et de caractériser les perturbations du développement et de l’activité des réseaux neuronaux sous-jacents
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
La prématurité touche entre 50 000 et 60 000 naissances par an et est en hausse sur ces dernières années. Comprendre ses effets à long terme c’est permettre de mieux le traiter à terme. Ainsi à travers notre projet nous pourrons évaluer : – l’effet de l’hypoxie sur l’activité neuronale global chez le nouveau-né -l’évolution de cette activité chez l’adulte à partir de l’enregistrement de l’activité cérébrale de l’animal -Cela nous permettra également de savoir à terme comment le sommeil paradoxal est impacté par ce phénomène.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
L’animal sera soumis à différents protocoles : Protocole 1 (classe modérée) : Après leur naissance, nous exposerons la moitié des animaux à une période d’hypoxie de 8 jours (réduction de la concentration d’oxygène à 10% correspondant à une altitude d’environ 4500 mètres). Les animaux seront ensuite immédiatement marqués après la période hypoxique par injection d’hydroxytamoxifen (4-OHT), marquant définitivement l’activation neuronale chez ces petits puis seront exposés à la suite des protocoles à l’âge adulte. Protocole 2 (classe modérée) : Les animaux seront implantés d’électrodes, permettant d’enregistrer l’activité cérébrale, sous anesthésie à l’âge de 12 à 16 semaines. Cette procédure est utilisée depuis de nombreuses années dans notre laboratoire et optimisée pour limiter son impact sur le bien-être animal. Après une période de récupération d’une semaine, les animaux seront enregistrées afin d’identifier leur activité cérébrale. Des mesures d’enrichissements seront mises en place pour permettre à l’animal d’exprimer un maximum de comportements naturels et compenser son isolement social durant les expérimentations. Protocole 3 (classe modérée) : Ensuite, nous exposerons les animaux, âgées de 12-16 semaines, à une privation spécifique de sommeil paradoxal (SP) pendant 48h. Cette privation conduit, une fois terminée, à une accumulation du SP dans un court lapse de temps (1h30) permettant d’observer son activation neuronale durant une période restreinte (~2h). Cette procédure a été initialement élaborée afin de limiter l’impact de l’expérimentation sur le bien-être animal.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
L’ensemble des procédures utilisées dans ce projet ont été élaborées et sont maîtrisés depuis plusieurs années au sein de notre laboratoire. Aucun signe indicatif de douleur n’a été remarqué pour ces procédures. Cependant, un suivi journalier des souriceaux sera effectué durant l’ensemble des protocoles. Certains effets indésirables minimes peuvent apparaitre : Protocole 1 : Outre les critères d’appréciations de l’état des mères (stress, léthargie…) et des petits (estomac vide, abandon de la mère…) durant la phase d’hypoxie il est possible d’observer une activité de la mère réduite lors de la mise en place de l’hypoxie (réduction du taux d’oxygène). Afin de limiter cet impact il est possible de réduire le taux d’oxygène par paliers afin de passer de 20.9% à 10%. De plus l’injection de 4-OHT peut induire une légère gêne des membres postérieurs de l’animal réduisant légèrement sa mobilité. Cet effet s’estompe généralement dans la demi-heure après injection. Protocole 2 : Les étapes de chirurgies induiront un effet négatif modéré sur le confort des animaux adultes. Outre les critères d’appréciations de l’état des souris post-chirurgie (réduction poids, posture, pelage …) il est possible d’observer chez l’animal des petites lésions/irritations induites par le toilettage de cette zone ou un grattage excessif autour de l’implant. L’application d’une pommade ou de Bétadine sur la zone lésée est alors recommandée. Protocole 3 : Aucun signe indicatif de douleur ni d’effet indésirable n’a été remarqué pour ce protocole.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Afin d’évaluer l’impact de l’hypoxie dans la mise en place du sommeil paradoxal chez les nouveaux nés et sur ses réseaux à long terme, tous les animaux seront euthanasiés afin de récupérer les tissus et effectuer une analyse histologique poussée (marquage immunohistochimique, densité de population neuronale …)
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’analyse in vivo reste incontournable pour ce projet de Recherche. En effet, les séquelles neurologiques posthypoxiques dépendent de mécanismes complexes impossibles à reproduire in vitro d’où la nécessité d’un modèle animal pour étudier la pathologie. De plus l’étude du SP ne peut être conduite sur des animaux de niveau phylogénétique inférieur (mouche, poisson rouge…). Par ailleurs, notre projet permet d’établir l’évolution d’une activité cérébrale et plus particulièrement du sommeil paradoxal au cours du développement chez les nouveaux nés et à l’âge adulte, nécessitant alors le modèle transgénique décrit précédemment et, par définition d’un modèle transgénique stable, des souris.
2. Réduction
La petite taille des lots de souris a été calculée au plus juste à partir de nos études antérieures utilisant les mêmes protocoles dans le but de générer des données reproductibles dont la significativité sera validée par les tests statistiques adaptés (Par exemple, si paramétrique, un test de variance Anova à deux dimensions, et si non paramétrique, à une seule dimension, Kruskal-Wallis avec comparaison multiple de Dunn). Elle tient donc compte des ‘’erreurs et échecs’’ qui peuvent survenir à chaque étape de la procédure expérimentale. Pour finir, nous avons mis en place dans l’équipe depuis plusieurs années un système de préservation de toutes les séries de coupes non utilisées. Cette banque de tissu, accessible à l’ensemble de l’équipe est mise à jour systématiquement lorsque de nouveaux tissus ont été produit à la suite d’une coupe de cerveau. Le nombre d’échantillon/puits de coupes disponibles y est indiqué et peut être utilisé à d’autres fins ou futurs projet si ces derniers ont déjà été exploités sur leur projet d’origine. Ainsi, elle permet d’optimiser sur le long terme l’utilisation du tissu tout en réduisant le nombre d’animaux utilisés.
3. Raffinement
De nombreuses actions de raffinement seront mises en place lors des procédures décrites dans ce projet. Toute procédure de chirurgie (implantation d’électrode…) est étudié pour durer le minimum de temps possible (environs 45min) et sera accompagnée systématiquement d’utilisation d’anesthésiques et d’analgésiques, et d’un suivi journalier des animaux afin de détecter et traiter immédiatement tout signe d’inconfort des animaux. Pour la procédure d’hypoxie, les femelles seront échangées tous les 2 jours entre les cages normoxiques et hypoxiques, afin de préserver la quantité et la qualité du lait qu’elles produisent pour nourrir leurs souriceaux, et de minimiser au maximum le stress conséquent à la procédure sur les animaux. Afin de prévenir le stress engendré par la manipulation de l’animal avant chirurgie par exemple, plusieurs handling seront effectuées les jours précédant le protocole et l’animal sera habitué au préalable à chaque condition (habituation au câble d’enregistrement, aux injections en IP…). Des critères d’interruption des expérimentations et d’exclusion (souffrance physique et psychique, perte de poids…) seront estimés avec une grille d’évaluation quotidienne, leur impact étant délétère sur le sommeil.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Notre projet nécessite l’utilisation d’animaux transgéniques afin d’évaluer l’influence de l’hypoxie au cours du temps sur l’activité cérébrale de l’animal et en particulier de l’activité du sommeil paradoxal. Les séquelles neurologiques post-hypoxiques dépendent de mécanismes complexes qu’il est impossible de reproduire in vitro. Un modèle animal est donc nécessaire pour étudier les conséquences à court et long terme de l’hypoxie sur l’activité du sommeil paradoxal. Or, la souris est un des modèles animaux les plus adaptées dans la mise en place d’un génome modifié. De plus l’ensemble des données précédentes recueillis par les différentes équipes sur l’impact de l’hypoxie et sur l’activité du sommeil paradoxal ont été effectuée chez la souris. Ainsi à travers notre protocole une partie des souriceaux seront soumis à une hypoxie de P3 à P11 (8 jours) lorsque les autres seront en condition normoxique. Ensuite l’ensemble des souris retourneront en condition d’hébergement standard jusqu’à l’âge de 12-16 semaines environs, période où l’implantation des électrodes sera effectué pour l’enregistrement de sommeil paradoxal à l’âge adulte une semaine plus tard.