Etude des cellules lymphoïdes innées de type 3 et de leur rôle dans la néogenèse des structures lymphoïdes tertiaires au cours de l’inflammation pulmonaire

Le projet vise à élucider les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à la formation des structures lymphoïdes tertiaires en conditions inflammatoires. La présence de ces structures a en effet été corrélée à un bon pronostic dans de nombreux types de tumeurs solides, et notamment dans les cancers du poumon non à petites cellules. Nous souhaitons étudier le rôle de cellules lymphoïdes innées dans la néogenèse de ces structures. L’étude des voies de signalisation à l’origine de l’induction de ces structures dans les poumons pourrait permettre à l’avenir leur manipulation à des fins thérapeutiques, avec l’identification de molécules candidates jouant un rôle dans leur néogenèse. L’expérimentation sera réalisée en utilisant un modèle inflammatoire visant à induire ces structures pulmonaires. Les objectifs principaux de ce projet sont : 1 – d’étudier la population de cellules lymphoïdes innées au cours de l’inflammation induite par un produit bactérien, par l’analyse cinétique des différents compartiments cellulaires des poumons de ces souris ; 2 – d’étudier la néogenèse des structures lymphoïdes tertiaires et la présence des cellules lymphoïdes innées pulmonaires au cours de l’inflammation, en présence ou absence de fibres nerveuses ; 3 – de transférer des cellules lymphoïdes innées pulmonaires chez des souris naïves ou ayant reçu un traitement avec une faible dose du produit bactérien, afin d’étudier la capacité des cellules transférées à induire ces structures en conditions non ou faiblement inflammatoires.

Ce projet a pour but d’élucider les mécanismes sous-jacents à la formation des structures lymphoïdes tertiaires, et plus particulièrement d’évaluer le rôle des cellules ILC3 dans ces processus. Pour cela, l’utilisation de souris rapportrices RORgt-EGFP dans lesquelles nos cellules d’intérêt expriment l’EGFP, représente un outil pour étudier cette population mais aussi pour les purifier en vue de réaliser des tests fonctionnels. Ce projet vise donc à mieux comprendre le processus de formation des TLS, et étudier la cible thérapeutique que pourraient représenter des ILC3 pulmonaires dans différentes maladies. Induire des TLS chez les patients cancéreux ouvrirait la voie à de nouvelles possibilités thérapeutiques tous stades de la tumeur confondus, et pourrait ainsi contribuer à allonger la survie de ces patients, même lorsqu’ils sont inopérables.

– Instillations intranasales : 5 instillations par voie intranasale (lent dépôt de 14 µL/narine de chaque souris maintenue verticalement ; durée totale environ 2-3 minutes/souris en fonction du rythme respiratoire) de NaCl 0,9% ou de LPS à des animaux préalablement anesthésiés. – Transfert adoptif d’ILC3 pulmonaires par voie intraveineuse : injection dans la veine de la queue de 100 µL de suspension cellulaire (1000 cellules en PBS 1X stérile) sur souris vigile, sous lampe chauffante et placée brièvement dans un dispositif de contention lors de l’injection (durée totale environ 1 minute, chauffage préalable environ 5-10 min). Cette intervention n’est réalisée qu’une fois par animal. – Injections de 6-OHDA par voie intrapéritonéale : Sur animal vigile, injection de 200 µL de NaCl 0,9% ou de 6-OHDA resuspendue en NaCl (100mg/kg puis une deuxième injection à 250 mg/kg 48h plus tard). Durée totale < 30 secondes. - Prélèvements : Tous les prélèvements (poumons, plasma) sont réalisés sur animaux euthanasiés par une méthode réglementaire.

Les animaux ne subiront aucune manipulation plus douloureuse qu’une injection ponctuelle par voie intra-péritonéale ou intraveineuse (cellules), ou une instillation intranasale (LPS) sous anesthésie générale. Les injections pourront provoquer l’apparition d’un stress chez les animaux, mais toutes sont rapides (pas plus de quelques secondes) et les animaux sont maintenus immobiles le temps de l’injection (voie i.p. ou i.v.) afin de limiter au maximum l’éventuelle douleur provoquée. Dans le cas des instillations intranasales, une gêne respiratoire pourra dans certains cas être observée au moment des instillations dans la narine.

A l’issue de chaque procédure, les poumons des animaux seront prélevés dans le but d’analyser les TLS pulmonaires ainsi que les ILC3. Les animaux devront donc être euthanasiés suite à l’inflammation induite par le LPS afin de prélever leurs poumons pour procéder aux analyses ex vivo décrites dans les procédures (suivi de la densité de TLS et de la population d’ILC3, purification d’ILC3 fonctionnelles pour leur utilisation in vitro et in vivo). Du sang sera également prélevé post mortem sur les animaux afin de procéder à des dosages plasmatiques de catécholamines, afin de s’assurer notamment de la dénervation du système nerveux sympathique.

La souris est l’animal permettant d’explorer le plus facilement la formation des TLS ainsi que les interactions entre cellules du système immunitaire et fibres nerveuses grâce à l’accessibilité d’un grand nombre de réactifs (ex. anticorps, cellules de lignée cellulaire tumorale transfectées avec l’ADNc codant la luciférase). Par ailleurs, les cellules immunitaires ont été exhaustivement caractérisées chez la souris : les marqueurs des cellules d’intérêt de cette étude sont connus et de nombreux anticorps spécifiques sont disponibles. Enfin, différents protocoles développés chez la souris sont décrits de façon détaillée dans la littérature et sont donc applicables sans nécessité de mises au point longues et consommatrices d’animaux. Les animaux seront reçus à l’âge de 12 semaines, puis mis en stabulation pendant une semaine minimum avant de débuter l’expérimentation (8 semaines pour la procédure 2). Cet âge a été choisi car à ce stade de développement, les souris sont sevrées, ont atteint une taille adulte et disposent d’un système immunitaire et nerveux mature. Les expériences durent entre 10 à 40 jours soit un âge maximum de 17,5 semaines (ou avant si les souris présentent des signes de souffrance, une perte de poids>20% de leur poids initial ou détresse respiratoire) à la fin de l’expérience.