Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 02/02/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-186435)
15 lapins vont être utilisés, tous tués à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par des souches vivantes de Brucella pour leur faire produire des anticorps, puis mis à mort par ponction cardiaque afin de récupérer leur sang et leurs organes. Le porteur indique que l’infection provoque une fièvre intermittente, une baisse d’appétit et une perte de poids, et présente cette production de sérums mutualisée en Europe comme visant à limiter le nombre de lapins utilisés. Il affirme qu’il n’existe « pas de méthode in vitro » de production de ces anticorps, tout en évoquant une piste à partir des cellules de rate pour « s’affranchir » à l’avenir de l’animal.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La brucellose est une maladie qui se transmet de l’animal à l’homme, et vice versa, causée par la bactérie Brucella, qui touche un très large spectre d’hôtes, incluant les hommes, de nombreuses espèces de mammifères et même les amphibiens. L’une des étapes du diagnostic consiste en l’identification de la souche de Brucella responsable de la maladie par un test rapide d’identification sur lame appelé typage bactériologique. Ce typage nécessite l’utilisation de sérums contenant des anticorps dirigés spécifiquement contre une espèce de Brucella, dit sérums monospécifiques. Notre premier objectif est la préparation de sérums monospécifiques contre quatres espèces de Brucella : deux espèces lisses de Brucella (B. abortus et B. melitensis), une espèce rugueuse (B. ovis) et une nouvelle espèce (BO3). Il permettra également de produire un sérum négatif (sans anticorps) pour la validation du biotypage (contrôle négatif) permettant l’identification du genre Brucella. L’expérimentation permettra également la production d’un sérum négatif indispensable pour la validation du biotypage. La production de sérums mono-spécifiques est mutualisée à l’échelle européenne, afin de limiter l’utilisation expérimentale de lapins vivants et devrait permettre d’obtenir une quantité de sérum visant à maintenir les capacités européennes de typage bactériologique pour 7 à 10 ans. Cette préparation de sérums monospécifiques sera réalisée en trois étapes : immunisation/inoculation de lapins au moyen de suspensions bactériennes vivantes de Brucella non atténuées ; prélèvement du sang des animaux infectés et des contrôles négatifs pour arriver à obtenir une concentration en anticorps suffisante pour la suite des étapes ; et élimination des anticorps non-spécifiques des sérums afin d’obtenir un sérum spécifique d’une seule espèce bactérienne. Ce projet permettra également de collecter les organes (foie, poumons, ganglions lymphatiques et organes reproducteurs) des animaux après mise à mort afin de constituer une collection de tissus positifs pour chacun des genres de Brucella qui serviront de contrôles positifs pour la validation des méthodes de diagnostic. Enfin, les cellules de la rate qui produisent des anticorps mono-spécifiques seront utilisées afin de développer un protocole de production in vitro d’anticorps mono-spécifiques et ainsi réduire si possible la nécessité d’utiliser des animaux.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Le projet vise à produire des réactifs (sérums monospécifiques et témoin négatif) permettant l’identification de l’espèce bactérienne de Brucella lors d’une suspicion de brucellose. Quatre sérums monospécifiques seront produit grace à ce projet, chaque sérum monospécifique étant constitué d’anticorps dirigés spécifiquement contre une espèce de Brucella. Un sérum « contrôle négatif » (sans anticorps) sera également produit. Ces sérums sont indispensables pour le typage bactériologique, et notamment pour une espèce récemment décrite (souche zoonotique de Brucella BO3) qui n’est à ce jour pas identifiable à l’aide des sérums existants, et pour laquelle les anticorps ne sont pas détectables par les méthodes d’immuno-sérologie classiques. Ces sérums seront utilisés comme réactifs par l’ensemble des laboratoires de référence de l’Union Européenne pour les diagnostiques de brucelloses animales. À ce jour, il n’existe pas de méthode in vitro de production d’anticorps et le recours à une infection expérimentale est le seul moyen d’obtenir ces anticorps spécifiques. Un autre bénéfice attendu du projet est d’obtenir à partir de la rate des lapins infectés des cellules productrices d’anticorps spécifiques contre le genre Brucella qui pourraient permettre de faire évoluer le protocole vers une production in vitro des sérums mono-spécifiques avec l’objectif de s’affranchir d’une expérimentation animale à l’avenir.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Tous les animaux utilisés (12 animaux au mimimum et 15 animaux au maximum) seront soumis à des prélèvements sanguins (1 mL) avant infection (à J-5), puis à J6 post-infection et éventuellement à J8 et J10 selon les résultats de la concentration sérique des prélèvements. Pour ce faire, les lapins sont tranquillisés par une injection intra-musculaire de Xylazine (5 mg/Kg) et d’acépromazine (0,75 mg/Kg) pendant 5 – 10 minutes. Soit au maximum 4 prélèvements par animal. À J0, les animaux dans l’animalerie A3 (8 animaux, par série de 2 animaux à la fois) seront infectés par une des 4 souches de Brucella dédiées (2 animaux infectés pour chaque souche). Pour ce faire, les lapins sont tranquillisés par une injection intramusculaire de Xylazine (5 mg/Kg) et d’acépromazine (0,75 mg/Kg) pendant 5 minutes. Soit une seule injection par animal. La technique de mise à mort est appropriée pour les lapins (selon l’annexe IV). Les lapins sont anesthésiés par un mélange Xylazine (35 mg/Kg) et de Kétamine (10 mg/Kg) injecté par voie intramusculaire pendant 15 minutes. L’anesthésie est confirmée par les tests de réflexe de retrait de la patte et de réflexe de la paupière. La mise à mort des lapins est assurée par une injection intracardiaque de 5 mL de barbiturate (Doléthal) après exsanguination par ponction cardiaque. Soit deux injections pour la mise à mort par animal.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les lapins sont des animaux sensibles à l’infection par Brucella spp. Les lapins de race New Zealand White sont choisis comme animal de laboratoire standard, avec une réaction connue à l’infection par Brucella spp.. La dose proposée est calibrée en fonction de la réaction du système immunitaire des lapins pour provoquer une forte réponse immunitaire (production d’anticorps par l’organisme) mais la durée de l’infection n’est pas suffisante pour que des symptômes non spécifiques se développent. D’après les expériences similaires décrites dans la littérature, la courte période de l’expérimentation et la dose infectieuse utilisée nous attendons chez les lapins les effets indésirables suivants : une fièvre intermittente de quelques jours, baisse d’appétit et par conséquent perte de poids. Après inoculation des agents pathogènes, l’état clinique des animaux sera contrôlé chaque jour, pour arrêter l’expérience si nécessaire par mise à mort de l’animal.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les animaux seront mis à mort pour récupération du sang total et des organes.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
La production de sérums monospécifiques n’est possible qu’à partir de l’immunisation d’animaux au moyen de suspensions bactériennes vivantes de Brucella non atténuées. En effet, la production d’anticorps spécifiques nécessite la stimulation de l’ensemble du système immunitaire pour la maturation des anticorps dans un modèle animal vivant sous conditions contrôlées. Cette production n’est réalisée que rarement, tous les 10 ans en moyenne, en mutualisant l’utilisation des réactifs à l’échelle européenne, afin de limiter l’utilisation expérimentale d’animaux. Nous profiterons de cette série de production pour isoler les cellules de rate, productrices des anticorps spécifiques contre la souche de Brucella inoculée, et les immortaliser. Cette étape pourrait nous permettre de faire évoluer le protocole vers une production in vitro des sérums mono-spécifiques et ainsi de s’affranchir d’une expérimentation animale à l’avenir.
2. Réduction
La production de sérums monospécifiques est mutualisée à l’échelle européenne afin de limiter l’utilisation expérimentale d’animaux vivants. Le modèle lapin a été choisi au regard de la quantité de sérum qui pourra être produite (50 mL de sérum monospécifique attendu pour un prélevement de sang total de 80 mL par lapin) et qui sera suffisante pour couvrir les besoins en sérum monospécifiques pour une longue durée tout en utilisant le moins d’animal possible. Le nombre minimal de lapins a été calculé pour chaque sérum monospécifique (2 lapins infectés et 1 animal témoin pour chaque espèce de Brucella), avec l’objectif d’obtenir une quantité de sérum permettant de maintenir les capacités européennes de typage bactériologique pour 7 à 10 ans, correspondant à une quantité d’environ 100 mL pour chaque sérum monospécifique.
3. Raffinement
A leur arrivée à l’animalerie les animaux seront hébergés dans des cages munies d’une plateforme de repos avec l’enrichissement nécessaire à leur bien-être (balles, branches en bois pour les dents et branches végétales). Les lapins étant très sensibles à la manipulation, ils seront surveillés et approchés quotidiennement pendant les sept jours d’acclimatation par les animaliers et les expérimentateurs pour les habituer à leur présence et aux manipulations. Après la periode d’acclimatation, les lapins destinés à l’infection seront transférés dans la zone confinée de niveau de sécurité biologique 3 de l’animalerie et placés dans des cages avec des branches en bois et des branches végétales comme enrichissement. Durant l’expérimentation, l’état clinique des animaux sera contrôlé quotidiennement, afin de suivre l’évolution de la température corporelle, l’évolution du poids, la prise de nourriture et l’état général des animaux. Avant tous prélèvements sanguins, prise de température et pesée, les animaux seront tranquillisés par une injection en intramusculaire de Xylazine (5 mg/Kg) et d’acépromazine (0,75 mg/Kg).
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Les lapins sont sensibles à l’infection par de nombreux agents pathogènes, dont les espèces classiques du genre Brucella. Les lapins de race New Zealand White sont choisis comme animal de laboratoire standard, avec une réaction connue à l’infection par Brucella spp. Les lapins utilisés pour l’expérimentation sont des adultes (race New Zealand White) présentant un poids de 3,5 à 4 Kg afin d’optimiser la quantité de sérum obtenue par animal.