Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 06/02/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-404949)
5040 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. 720 d’entre elles subissent trois chirurgies des testicules, une laparotomie et des aspirations de l’épididyme, puis une vingtaine de séances d’imagerie sous anesthésie sur 120 jours, les 4320 autres une chirurgie testiculaire avant une mise à mort échelonnée pour prélever les spermatozoïdes. Le porteur vise une thérapie de l’azoospermie masculine, un bénéfice renvoyé au stade préclinique et au conditionnel. Il affirme que la spermatogenèse ne se reproduit pas in vitro et conclut que le modèle souris est « incontournable ».
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’infertilité est un problème fréquent : 1 couple sur 7 serait concerné en France. L’infertilité est définie comme étant l’incapacité à obtenir une grossesse après un an de rapports sexuels réguliers sans moyen de contraception. On estime que dans la moitié des cas, l’infertilité est d’origine masculine. Certains hommes souffrent d’une absence totale de spermatozoïdes dans leur sperme. Ce phénomène concerne environ 15 % des hommes infertiles et se nomme « azoospermie non obstructive ». À l’heure actuelle, des solutions sont apportées aux couples souffrant d’infertilité grâce au développement des techniques de Procréation Médicalement Assistée (PMA). Néanmoins, ces approches ne s’appliquent pas aux patients souffrant d’azoospermie non obstructive, car elles nécessitent la présence de spermatozoïdes. De nouvelles stratégies thérapeutiques doivent être mises en place pour ces patients. L’azoospermie non obstructive est souvent liée à des défauts au niveau d’un seul gène, ce qui entraine l’absence de la protéine normalement produite grâce à ce gène. L’objectif de ce projet est de développer de nouvelles approches pour ces hommes infertiles qui ne peuvent pas être traités par la PMA. Il s’agit de réintroduire dans les cellules germinales productrices de spermatozoïdes, le message génétique capable de produire cette protéine manquante: soit de l’ADN du gène manquant ; soit de l’ARNm qui code pour la protéine manquante. Il ne s’agit pas de thérapie génique, car il n’y aura pas d’intégration dans le génome des cellules germinales, ce dernier ne sera donc pas modifié. Les molécules, ADN ou ARNm, seront injectées au niveau des testicules. Le message génétique ainsi introduit permettra ensuite aux cellules de produire la protéine manquante et de restaurer la fertilité.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet pré-clinique pourrait conduire à la mise au point d’une technique innovante de prise en charge de l’azoospermie non obstructive, une cause importante d’infertilité masculine.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les animaux sont répartis en deux procédures : -Les animaux de la première procédure PE1 (720) vont subir 3 chirurgies de 30 min sous anesthésie générale une au niveau des testicules, une laparotomie et 3 aspirations maximum au niveau des épididymes pour prélever des spermatozoïdes. Les chirurgies seront réalisées avec un intervalle de 7 jours minimum entre deux chirurgies. Ils subiront 20 séances d’imagerie sous anesthésie générale d’une durée de 10 min maximum et espacée de 7 jours sur une période de 120 jours. Seules les souris de la PE1 injectée avec ADN subiront en plus 20 injections de luciférines pour permettre l’imagerie in vivo par bioluminescences. . À la fin du cycle d’imagerie de chaque souris (120 jours), les souris seront euthanasiées pour réaliser des coupes histologiques des testicules. – Les animaux de la deuxième procédure PE2 (4320) vont subir une chirurgie de 30 min sous anesthésie générale au niveau des testicules. Ensuite, les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale à 6 temps 1-2-7-15-21-35 jours post injection afin de prélever les spermatozoïdes et les testicules. Dans cette deuxième procédure, aucun prélèvement ne sera réalisé sur animaux vivants.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
L’anesthésie des animaux demandera leur préhension. Suite à la chirurgie, les males pourront perdre du poids et avoir une mobilité réduite sur quelques jours seulement. Les animaux transportés entre les deux animaleries pour réaliser les séances d’imagerie pourraient avoir un stress engendré par le transport.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure, les testicules seront prélevés pour réaliser des coupes histologiques. Ce qui nous permettra de vérifier la qualité de la restauration de l’infertilité.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’étude des mécanismes de la spermatogenèse et de l’ovogenèse, ainsi que de l’infertilité nécessite l’utilisation des animaux car ces processus ne sont pas reproductibles in vitro, et il n’existe pas de système de culture cellulaire permettant d’obtenir des gamètes viables. La fécondation nécessite l’obtention de gamètes matures, qui ne peuvent être obtenus que sur des animaux. L’étude des phénotypes d’infertilité humaine nécessite des animaux présentant les mêmes défauts que ceux observés chez les patients. En conclusion, il nous est impossible de remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou de simulation informatique. En effet, aucun modèle alternatif ne permet encore de reproduire en globalité la complexité de la gamétogenèse et les impacts sur la fertilité.
2. Réduction
Le nombre minimal d’animaux sera utilisé dans chaque procédure tout en garantissant une étude statistique correcte . La procédure d’imagerie in vivo va nous permettre de réduire le nombre d’animaux utilisé puisque les souris seront imagées à différents temps post-chirurgie sur une période de 4 mois. L’aspiration micro-chirurgicale de spermatozoïdes épididymaire et l’aspiration percutanée de spermatozoïdes épididymaires permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés puisque chaque souris sera utilisée pour plusieurs mesures. Les deux testicules de chaque souris seront injectés, le testicule gauche sera injecté avec du PBS, il va servir de contrôle et le testicule droit sera injecté avec l’ADN ou de l’ARN. Cela va nous permettre de réduire le nombre d’animaux utilisés. Les deux techniques de transfection sonoporation et électroporation évoquées en PE1 et PE2 seront effectuées en parallèle mais nous n’utiliserons pas la technique non efficace dans la P2.
3. Raffinement
Les douleurs associées à la chirurgie sont traitées avec des anti-douleurs et des anesthésiques. L’acte chirurgical sera réalisé sur des tapis chauffants et le réveil se fera dans une cage chauffée. La personne réalisant la chirurgie attendra le réveil de tous les animaux. Suite à l’opération, des croquettes mouillées seront disposées dans la litière. Pendant l’opération, les yeux seront recouverts d’une pommade pour les yeux (Vitamine A Dulcie). Les opérations seront réalisées le matin et le comportement des animaux sera suivi toutes les heures dans l’après-midi. L’état de santé des animaux opérés sera quotidiennement suivi aprés l’opération pendant 7 jours . En cas d’inflammation et/ou suppuration, la souris sera traitée avec un antibiotique non critique par voie intra-péritonéale pendant 5 jours. Le suivis de l’état de santé des animaux est réaliser dans le respect des 3R et se basent sur un arbre décisionnel en fonction des observations faites pour l’application des points limites gradés précis, et qu’en cas de dépassement des points limites les souris sont sortie de l’étude et sacrifiées (critères d’arrêt).
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Grâce aux connaissances acquises ces dernières années sur la génétique de la souris et du fait de la conservation, entre l’homme et la souris, de la majorité des gènes impliqués dans la gamétogenèse et la fécondation, la souris représente actuellement le modèle de choix pour étudier les causes génétiques de l’infertilité. L’utilisation du modèle de souris est incontournable car il n’existe à l’heure actuelle aucune technique permettant la production de spermatozoïdes ou d’ovocytes in vitro. Dix modèles de souris transgéniques seront utilisés pour les besoins de cette étude. Toutes les lignées de souris utilisées constituent des modèles d’inactivation génique ou de transgenèse additive qui ne concerneront que des gènes impliqués dans la fonction de reproduction. Lors de leur entrées dans les procédures les souris males utilisées seront matures, âgées minium de 6 semaines,car la spermatogenése n’est pas fonctionnelle avant 6 semaines