Identification et caractérisation des nanotubes dans le cerveau de souris.

Le développement du cerveau est un ensemble de processus complexes durant lequel les cellules se divisent, migrent, se différencient, forment des circuits neuronaux et deviennent matures. Le bon déroulement de chacun de ces processus nécessite que les cellules puissent communiquer entre-elles, même à longues distances. Perturber cette communication peut altérer ces différents processus et engendrer des troubles du neurodéveloppement. Il a été montré, in vitro, que les cellules neurales peuvent former des nanotubes (TNTs), des connexions membranaires entre cellules distantes, parmi lesquelles on compte les cellules granulaires du cervelet. Deux types de TNTs ont été définis. Ils peuvent être ouverts à chaque extrémité et permettre ainsi le transfert de matériels cellulaires larges comme les organelles. Ils peuvent également être fermés à une extrémité par une jonction gap et permettre le couplage électrique entre cellules. Notre hypothèse est donc que les TNTs pourraient permettre aux neurones de communiquer entre eux par couplage électrique et/ou par des échanges de matériels cellulaires, notamment par transfert d’organelles, durant la période développementale. Dans ce projet, nous souhaitons identifier et caractériser les TNTs in vivo en prenant comme modèle le cervelet. Une fois que nous aurons confirmé la présence des TNTs et identifié leur localisation, nous nous assurerons que ces TNTs sont fonctionnels. Durant les deux premières semaines post-natales, les cellules granulaires du cervelet prolifèrent intensément. Durant la cytokinèse, dernière phase de la multiplication cellulaire, la membrane cellulaire se rétrécit entre les deux cellules filles, de manière à former transitoirement un pont, appelé pont cytokinétique. La fin de la multiplication cellulaire se traduit normalement par la suppression de ce pont, séparant ainsi totalement les deux cellules filles formées. Toutefois, il arrive que ce pont cytokinétique persiste et, à la manière des TNTs, permette aux deux cellules filles qu’il connecte de communiquer, via des échanges de matériel cellulaire. Nous étudierons donc également la présence de ces ponts cytokinétiques persistants ainsi que la possibilité que les cellules granulaires du cervelet puissent les utiliser pour communiquer entre elles.

Les résultats de ce projet pourraient changer notre conception de la communication entre neurones, qui était jusque-là limitée aux notions relatives aux synapses. Nous mettrons ainsi en lumière un rôle possible des TNTs dans le développement précoce des réseaux neuraux. Ces résultats pourraient aussi améliorer notre compréhension des processus impliqués dans le développement du cervelet. Enfin, mettre en évidence l’existence de TNTs a également le potentiel d’ouvrir à long-terme de nouvelles voies pour le traitement de maladies non seulement neurodéveloppementales mais aussi neurodégénératives, actuellement incurables.

Les animaux subiront au plus une seule procédure chirurgicale. Un premier groupe d’animaux nouveau-nés subira une seule intervention chirurgicale d’une durée de 30 minutes maximum sous anesthésie et analgésie profonde précédée et suivie d’injections intra-péritonéale répétées sur 72h00. Un deuxième groupe d’animaux nouveau-nés subira une seule intervention chirurgicale d’une durée de 30 minutes maximum sous anesthésie et analgésie profonde. Un troisième groupe de souris nouveau-né subira une à trois injections intra-péritonéales (chaque injection durant quelques secondes).

Procédures 1, 2, 3 : L’électroporation peut induire un arrêt cardio-respiratoire conduisant à la mort de la souris nouveau-née dans les minutes qui suivent la délivrance des pulses électriques. La séparation maternelle de plusieurs heures peut induire un stress pour la mère et les souris nouveau-nées. La chirurgie sur les souris nouveau-nées peut induire du cannibalisme par la mère. Des pertes de poids, des douleurs et réactions inflammatoires peuvent être induites par la chirurgie. Procédures 1 et 4: Les injections intra-péritonéales peuvent induire des sensations désagréables de piqûre et des douleurs abdominales modérées.

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de réaliser des analyses histologiques ou électrophysiologiques.

Nos questions biologiques nécessitent d’induire des modifications génétiques. De nombreux outils de manipulation génétique sont disponibles chez la souris, ce qui en fait un modèle animal de choix pour notre projet. De plus, l’organisation du cerveau de souris présente des similarités avec le cerveau humain, ce qui en fait un bon modèle pour étudier le développement du cerveau. Des travaux ont notamment démontré que la souris est un modèle d’étude valide pour étudier les défauts de développement du cervelet. Dans ce projet, nous utiliserons des souris WT et des souris transgéniques permettant de : – Cibler les cellules progénitrices granulaires du cervelet et leurs progénitures. – Cibler toutes les cellules d’origine neuronale. – Suivre les neurones grâce à un marquage fluorescent. – Stimuler l’activité des neurones. Le développement postnatal du cervelet se fait entre les jours postnataux 0 à 21. Au jour postnatal 0, la majorité des cellules progénitrices sont en prolifération, le nombre de cellules progénitrices arrêtant de se diviser augmente progressivement jusqu’à être presque totale au jour postnatal 14. Au jour postnatal 21 ces cellules ont toutes fini de migrer vers leur position finale. Pour les expériences d’électroporation nous devons donc cibler les cellules progénitrices le plus tôt possible (entre le jour postnatal 0 et 5). La mise à mort des animaux qui serviront à identifier la présence des nanotubes et à caractériser leurs fonctions se fera au jours postnatal 7, une période où les cellules progénitrices prolifèrent encore intensivement et où on peut également observer les cellules qui effectuent leur migration, mais aussi au jour postnatal 14, lorsque le développement du cervelet est presque terminé. Des animaux adultes seront également utilisés pour générer les animaux entrant dans les différentes procédures.