Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 15/02/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-919008)
910 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les protocoles, on leur greffe des cellules tumorales sous la peau ou dans la prostate par chirurgie, ou on déclenche des tumeurs par injections de tamoxifène, avant des séries d’injections répétées et des séances d’imagerie sous anesthésie s’étalant jusqu’à dix-huit mois. Le porteur indique que les souris développent des tumeurs et une dégradation progressive de leur état général, encadrées par des points limites. Le projet vise à confirmer chez la souris le rôle de la signalisation calcique dans le cancer de la prostate et à tester un anticorps, l’application chez l’humain restant présentée comme une perspective.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’objectif du projet consistera à permettre une validation in vivo de nos résultats obtenus in vitro à savoir : -la signalisation calcique est impliquée dans la croissance tumorale en réponse à une stimulation du système nerveux parasympathique -la signalisation calcique est impliquée dans la résistance aux traitements chimiothérapeutiques -la signalisation calcique est impliquée dans la formation des métastases osseuses du cancer de la prostate -la signalisation calcique est une cible thérapeutique potentielle in vivo.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Les enjeux en matière de cancérologie sont importants car nous avons identifié in vitro que la signalisation calcique un rôle central dans plusieurs mécanismes clés de la cancérogenèse (prolifération, angiogenèse, métastase, apoptose, résistance aux chimiothérapies…). Nous devons confirmer ces données obtenues in vitro par des études chez la souris. Une autre application importante de ce projet sera l’étude de l’efficacité d’un anticorps monoclonal ciblant spécifiquement la signalisation calcique des cellules tumorales afin de stopper la progression tumorale. L’anticorps testé pourra être modifié et utilisé chez l’homme comme thérapie seule ou en combinaison contre les cancers prostatiques avancés aujourd’hui incurables.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Procédures 1,2 et 5: 1 Anesthésie à l’isoflurane (10 min) suivie d’1 injection sous-cutanée de cellules tumorales. Une fois par semaine (pendant 9 semaines): traitements avec les chimiothérapies ou solvant seul (1 injection intra péritonéale/sem soit 9 IP) et/ou 1 administration per os/sem de Rucaparib (ou solvant seul) (soit 9 PO) et/ou 1 injection IP de l’anticorps monoclonal ou son peptide contrôle (à renouveler tous les 3 jours) (soit 21 IP). Procédure 3 : 1 Anesthésie par isoflurane avant la procédure chirurgicale (implantations dans la prostate de cellules cancéreuses humaines à l’aide de seringues à insuline). Puis, chaque semaine (durée étude 25 semaines), la progression de la maladie sera surveillée par imagerie petit animal à bioluminescence : 1 injection (100 µL) IP de luciférine (25 IP au total) puis 1 Anesthésie à l’isoflurane (25 AG au total) puis imagerie. A partir de la semaine 4 et pendant 21 semaines, traitements appropriés comme indiqué (anticorps ou anticorps-CTL ; à renouveler tous les 3 jours soit 49 IP; docetaxel 1 IP/sem soit 21 IP; inhibiteur de PARP 1 IP/sem soit 21 IP ; docetaxel+PARP 1 IP/sem soit 21 IP). L’influence du système nerveux périphérique sera également évaluée avec un antagoniste des voies cholinergiques/muscariniques (darifenacin (Chrm3)). A partir de la semaine 4, les souris concernées recevront une IP journalière de darifenacin à 2.5 mg/kg dans du PBS ou du PBS seul (soit 147 IP). Procédure 4: durée de 18 mois. 5 IP intrapéritonéales consécutives à la semaine 2 (souris âgées de 15 jrs) pour l’administration du tamoxifène ou du solvant seul (huile de maïs). A partir de la semaine 4, les souris concernées recevront une IP journalière de darifenacin à 2.5 mg/kg dans du PBS ou du PBS seul (476 IP au total). Pour toutes les souris de la procédure 4: 36 anesthésies par isoflurane (pour chaque souris tous les 15 jours) afin de réaliser un suivie par imagerie petit animal à rayon X de l’apparition des métastases osseuses.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les souris concerneront la douleur et la maladie puisque les souris vont développer des tumeurs selon trois approches : xénogreffes sous cutanées, xénogreffes orthotopiques protatiques ou tumeurs spontanées. Pour les xénogreffes sous cutanées (Procédures 1, 2 et 5), une injection souscutanée de cellules tumorales sera réalisée au niveau du dos sous anesthésie générale. Il n’y aura pas d’autres nuisances causées par d’autres actes expérimentaux par la suite hormis les différents traitements (chimiothérapies, anticorps) que subiront les différents groupes de souris et qui seront injectés en intra-péritonéal. Pour les xénogreffes orthotopiques protatiques (Procédure 3), une injection intra-prostatique de cellules tumorales sera réalisée également sous anesthésie générale. Un acte chirurgical sera nécessaire. Il n’y aura pas d’autres nuisances causées par d’autres actes expérimentaux par la suite hormis les différents traitements que subiront les différents groupes de souris et qui seront injectés en intra-péritonéal. Cependant, chaque semaine, la progression de la maladie sera surveillée par imagerie petit animal à bioluminescence (non invasif) et une anesthésie générale à l’isoflurane sera nécessaire. Enfin, en ce qui concerne les tumeurs spontanées (Procédure 4), les souris recevront une administration de tamoxifène par injection intrapéritonéale une fois toutes les 24 heures pendant 5 jours consécutifs afin d’induire la délétion d’ORAI3 spécifiquement dans la prostate. Il n’y aura pas d’autres nuisances causées par d’autres actes expérimentaux par la suite hormis les différents traitements que subiront les différents groupes de souris et qui seront injectés en intra-péritonéal. Cependant, chaque semaine, la progression de la maladie sera surveillée par imagerie petit animal à rayon X (non invasif) et une anesthésie générale à l’isoflurane sera nécessaire. En ce qui concerne les nuisances ou effets indésirables attendus et engendrés par suite des expérimentations (conséquences, phénotype), les souris vont développer des tumeurs et donc des douleurs pourront apparaître avec une détérioration progressive de l’état générale. Ainsi, pour chaque procédure des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces pour permettre de limiter la douleur à son minimum, sans remettre en cause les résultats du projet sont présentés.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux des différents protocoles seront euthanasiés sans douleur à la fin de chaque procédure expérimentale afin de récupérer les tumeur pour réaliser des analyses omics.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Les caractéristiques morphologiques, physiologiques et immunologiques de la souris ne sont pas reproductibles in vitro. De même, l’influence de l’innervation qui est un paramètre que nous souhaitons examiner n’est pas reproductible in vitro. La délétion de manière inductible et spécifique dans les cellules épithéliales de la prostate permettra d’évaluer précisément le rôle de la protéine ORAI3 au sein d’un microenvironnement composé de différents type cellulaires (cellules nerveuses, stromales, immunes) dans différents contextes physiologiques et physiopathologiques. De plus, l’utilisation d’animaux d‘expérimentation comme la souris est particulièrement pertinente dans le cadre de la recherche en cancérologie afin de confirmer in vivo l’intérêt de nouvelles associations de chimiothérapies ou l’utilisation d’un anticorps monoclonal thérapeutique dont nous avons montré in vitro l’efficacité
2. Réduction
Afin de réduire la variabilité des résultats, l’environnement des souris et leur statut sanitaire seront contrôlés. Des tests statistiques appropriés ont été utilisés afin de déterminer le nombre nécessaire et suffisant de souris par lot. La randomisation sera également appliquée afin de supprimer certains risque de biais. Au total, ces mesures permettent de réduire au maximum le nombre des animaux utilisés pour les procédures expérimentales.
3. Raffinement
Les souris cohabiteront par groupe de 5 dans des cages adaptées en termes de surface et 3 enrichissements seront prévus (tunnel, coton, igloo rouge) pour réduire le stress des animaux. Aucun nouvel animal ne sera introduit dans des groupes déjà formés. L’environnement des animaux, l’équipement, système d’abreuvoir, la qualité de l’eau, la nourriture et la litière seront contrôlés régulièrement. L’état de bien être des souris sera également évalué quotidiennement par l’observation des signes physiques, physiologiques et comportementaux (perte de poids, aspects du pelage, morsures…). Lors de chaque anesthésie, la température des animaux sera maintenue grâce à l’utilisation de coussins chauffants. De plus, un gel oculaire (à base de vaseline) est appliqué au niveau des yeux des animaux pour éviter tout dessèchement de la cornée à chaque anesthésie. Nous allons utiliser des analgésiques et/ou des anesthésiques locaux adaptés afin de prévenir et/ou réduire au maximum la douleur chez les animaux.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
L’innervation du cancer de la prostate est un paramètre que nous souhaitons examiner et n’est pas reproductible in vitro. Le modèle murin est aujourd’hui validé pour l’étude de l’innervation du cancer de la prostate. Les protocoles seront réalisés avec des souris mâles âgées de 5 semaines. En effet, pour les expériences utilisant des souris immunodéprimées (nude) il est connu que les souris d’un âge plus avancé peuvent récupérer des lymphocyte T par rapport aux souris jeunes. Dès lors, pour les autres souris du projet et afin de pouvoir comparer les différents groupes nous utiliserons pour tout le projet des souris âgées de 5 semaines. Pour la procédure3: des souris plus âgées seront utilisées (8 semaines car il nous faut attendre la maturité sexuelle des mâles soit 8 semaines pour réaliser les injections intra-prostatiques). Pour la procédure 4: le développement tumorale sera induit par injections de tamoxifène sur des souris âgées de 15 jours et l’étude de survie durera 18 mois.