Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 16/02/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-274928)
508 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chez une partie d’entre elles, une inflammation intestinale est provoquée par du sulfate de dextran dans l’eau de boisson, et un cancer colorectal est induit par l’ajout d’azoxyméthane, le porteur indiquant que ces traitements causent des diarrhées et une perte d’environ 20 % du poids. Les animaux sont ensuite tués pour prélever leurs organes et analyser leurs lymphocytes. L’objectif déclaré est de caractériser une interaction entre le microbiote et le système immunitaire, que le porteur juge « indispensable » à explorer chez la souris pour établir un lien de causalité.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’ensemble des microbes colonisant l’organisme est appelé le microbiote. Ces microbes assurent des fonctions essentielles telles que la digestion et la protection contre les agents pathogènes, mais peuvent aussi exacerber l’inflammation intestinale chez les patients atteints de maladie de Crohn ou de rectocolite hémorragique et peuvent contribuer au développement du cancer colorectal, qui représente la deuxième cause de décès par cancer en France et dans le monde. Le système immunitaire, et notamment les lymphocytes T, jouent un rôle central dans la surveillance du microbiote notamment intestinal, et dans la réduction de l’inflammation du colon. Déchiffrer les interactions entre les lymphocytes T et le microbiote, chez les sujets sains et en cas d’inflammation intestinale, est donc essentiel pour comprendre les nombreuses pathologies associées au microbiote. Les fonctions des lymphocytes T reposent sur leur capacité à reconnaitre des molécules microbiennes appelées antigènes. L’un de ces antigènes est produit par certaines bactéries du microbiote. Les lymphocytes reconnaissant cet antigène microbien sont activés chez les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin et de cancer du colon, ainsi que dans les modèles d’inflammation intestinale chez la souris. Cependant des éléments essentiels sont manquants pour bien comprendre cette interaction entre les lymphocytes T et le microbiote : – Quelle est la distribution de ces antigènes dans le corps après production par les bactéries du microbiote? – Quelle est la durée de vie in vivo des antigènes fabriqués par le microbiote ? – Quelle est le rôle (bénéfique ou délétère) de cette interaction dans l’inflammation intestinale et le cancer colorectal ? L’objectif général du projet est donc de caractériser une intéraction entre le microbiote et le système immunitaire et de définir son rôle (bénéfique ou délétère) en cas d’inflammation intestinale.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet améliorera notre compréhension d’une nouvelle interaction entre le système immunitaire et le microbiote intestinale. Cette interaction est impliquée dans l’inflammation intestinale et le développement du cancer colorectal. Le projet peut donc offrir de nouvelles opportunités thérapeutiques.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Procédure 1: 1 injection par voie intrapéritonéale ou orale (1 minute, 1 fois au cours de l’expérience) sur animaux vigiles, ou 1 administration par voie cutanée, intranasale ou intrarectale (1 fois au cours de l’expérience) sur animaux anesthésiés pendant 20 min. Procédure 2: 1 injection par voie intrapéritonéale (1 minute, 1 fois au cours de l’expérience) sur animaux vigiles. Procédure 3: 6 injections par voie intrapéritonéale (1 min à chaque injection) sur animaux vigiles. Procédure 4: sel de sulfate de dextran dans l’eau de boisson pendant 7 jours. Pour un groupe d’animaux: 5 injections par voie intrapéritonéale (1 minute par injection) sur animaux vigiles avant administration de sel de dextran dans ml’eau de boisson. Procédure 6: 5 injections par voie intrapéritonéale (1 minute par injection) sur animaux vigiles. Puis les animaux recevront du sel de sulfate de dextran dans l’eau de boisson pendant 3 cycles de 5 jours. Chaque cycle est suivi de 4 jours sans traitement. Procédure 7: 6 injections par voie intrapéritonéale (1 minute par injection) sur animaux vigiles. Puis les animaux recevront du sel de sulfate de dextran dans l’eau de boisson pendant 3 cycles de 4 jours. Chaque cycle est suivi de 16 jours sans traitement.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les nuisances attendues lors de l’administration de l’antigène microbien par voie intrapéritonéale seront celles liées à l’injection intrapéritonéale. Nos études précédentes ont montré que l’antigène microbien n’a pas d’effet toxique in vivo chez la souris. Suite aux injections intrapéritonéales de tamoxifène, une perte de poids d’environ 10% du poids initial est attendue. Le poids initial est retrouvé une semaine plus tard. L’inflammation intestinale est induite par administration de sel de sulfate de dextran (DSS) dans l’eau de boisson, et peut causer des diarrhées entrainant une perte de poids d’environ 20% du poids initial. Le poids initial est retrouvé 2-7 jours après la fin du traitement. Le cancer colorectal est induit par une injection intrapéritonéale d’azoxymethane suivie de 3 périodes de traitement au DSS pour induire une inflammation intestinale pendant 7 jours, qui peut engendrer des diarrhées et une réduction du poids correspondant à 20% du poids initial. Le poids initial est retrouvé 2-7 jours après la fin du traitement.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem : collecte des organes et analyses par microscopie ou cytométrie en flux.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Nous avons analysé in vitro la capacité de différentes lignées cellulaires humaines et de cellules humaines et murines de différents tissus à capturer l’antigène microbien qui nous intéresse et à le présenter aux lymphocytes T spécifiques. Ces informations sont utiles mais ne permettent pas de conclure quant au rôle de ces cellules in vivo. Le projet a pour but maintenant d’étudier la distribution de l’antigène in vivo chez la souris. L’utilisation du modèle Souris reste indispensable pour définir les propriétés de cet antigène dans un organisme vivant intégré. Concernant le role de cet antigène dans l’inflammation intestinale, les données obtenues chez l’humain ont permis de documenter un enrichissement en bactéries capables de fabriquer l’antigène chez les patients atteints de maladie inflammatoire chronique de l’intestin et de cancer colorectal par rapport aux sujets sains, ainsi qu’une activation des lymphocytes spécifiques dans l’intestin. Ces données sont intéressantes mais ne permettent pas d’établir un lien de causalité entre changement du microbiote et activation des lymphocytes T. Le rôle (bénéfique ou délétère) de cette interaction hote-microbiote ne peut pas non plus être déterminé dans des modèles in vitro ou ex vivo. Le modèle animal est donc nécessaire à ce stade.
2. Réduction
Nous utiliserons des modèles d’inflammation intestinale et de cancer du colon induit par l’inflammation chez la souris. Les modèles ont déjà été mis en place et toutes les souris inclues dans le protocole peuvent être étudiées, limitant ainsi le nombre d’animaux à utiliser. Le nombre minimum d’animaux qu’il faut utiliser pour répondre aux questions posées a été calculé en utilisant un test statistique. Ce nombre a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats.
3. Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe sociaux et non isolés. Ils bénéficieront de matériel d’enrichissement (igloos, tunnels). Les animaux seront anesthésiés avant toute administration intranasale ou intrarectale. En accord avec les recommandations internationales dans le domaine de la cancérologie, les animaux seront suivis quotidiennement afin d’assurer leur bien-être et les expérimentations sont arrêtées avant la souffrance des animaux. L’inflammation intestinale et le développement de tumeurs sont induits par administration de produits chimiques et peuvent causer des diarrhées. En cas de déshydratation, les souris seront réhydratées par voie intra-péritonéale et un gel hydratant sera placé dans la cage. Nous utiliserons une grille de score pour évaluer de façon objective l’état des animaux et des points limites adaptée aux signes cliniques associés à l’inflammation intestinale.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris est l’espèce dans laquelle les lymphocytes T ont été largement étudiés (en dehors de l’humain) et pour laquelle nous disposons d’outils moléculaires et génétiques permettant leur étude. La souris est également le modèle de choix pour l’étude de l’inflammation intestinale et du cancer du côlon, du fait de l’existence de modèles bien définis, de la similarité de la flore intestinale, et de la parenté génétique avec l’humain. -Les souris seront utilisées à l’âge adulte. -Nous utiliserons des souris adultes car nous souhaitons que les souris aient un système immunitaire et un microbiote matures.