Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 21/03/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-869299)
848 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant jusqu’à modéré, certaines menées sous anesthésie sans réveil. Elles sont infectées par des microsporidies (Encephalitozoon cuniculi et E. intestinalis) dans l’oreille ou par gavage, puis observées par imagerie intravitale sous anesthésie, avant d’être tuées pour prélever oreille, ganglion et muqueuse intestinale. Le porteur décrit une réponse inflammatoire locale qu’il qualifie de minime et indique que tout signe de souffrance, poil hérissé ou baisse de motricité, entraîne l’euthanasie immédiate. Il affirme que l’analyse in vitro reste largement insuffisante pour saisir la réponse immunitaire in vivo et renvoie au futur les retombées, des stratégies immunothérapeutiques.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’immunobiologie des microsporidioses est un domaine encore peu exploré. Parmi les composants cellulaires de la réponse immunitaire anti-microsporidie, les cellules dendritiques et les macrophages représentent des cellules clés qui vont faciliter la transition entre la réponse immunitaire innée et adaptative chez l’hôte infecté. Or, le parasite est capable de moduler cette réponse. Parmi les mécanismes d’échappement immunitaire décrits in vitro, citons l’exemple d’Encephalitozoon avec E. cuniculi qui se réplique à l’intérieur des macrophages par inhibition de l’acidification du phagosome et absence de fusion phagolysosomale. E. intestinalis interfère quant à lui avec différents aspects de la physiologie des cellules dendritiques : leur différenciation, leur maturation, la production de cytokines, induisant ainsi un « priming » aberrant des lymphocytes T. Ainsi, les microsporidies « piratent » le système immunitaire de l’hôte, mais peu de données existent encore sur la mise en place de ces stratégies d’échappement in vivo. Notre projet vise à explorer in vivo, chez la souris, la mise en place de la réponse immunitaire anti-microsporidie, en étudiant en temps réel les interactions entre les microsporidies et les composantes cellulaires de la réponse immunitaire innée (macrophages, polynucléaires neutrophiles, cellules dendritiques). Le modèle du pavillon de l’oreille de la souris comme support pour l’analyse de la dynamique de la réponse immunitaire par imagerie intra-vitale est un des plus utilisés. Un travail récent a étudié les interactions entre les cellules de l’immunité innée et le staphylocoque doré. L’objectif est ici d’adapter ce modèle à l’étude de l’immunobiologie des microsporidioses. Nous proposons également d’étudier la réponse immunitaire anti-microsporidie au niveau de la muqueuse intestinale, dans le modèle de l’anse iléale de la souris. En infectant avec l’espèce E. Cuniculi, puis E. intestinalis plus fréquemment retrouvée chez l’homme, le modèle murin intestinal mis au point mimera au mieux la physiopathologie de l’infection humaine par ce parasite intestinal.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
De façon globale, ce projet nous apportera des connaissances nouvelles pour une meilleure compréhension de la réponse immunitaire dirigée contre les espèces microsporidiennes E. cuniculi et E. intestinalis, un domaine encore peu exploré à ce jour. L’objectif in fine sera de développer des stratégies immunothérapeutiques permettant de mieux contrôler ces infections dans le futur.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
-Expériences d’imagerie intravitale sur le tissu de l’oreille : le tissu cutané de l’oreille est imagé en microscopie confocale (imagerie intravitale) après inoculation des parasites (spores infectieuses) chez l’animal anesthésié (de quelques heures à 6 jours après l’infection)(durée: 2h, 5 interventions au total). Les animaux sont euthanasiés à la fin de l’expérience. -Expériences avec biopsies de tissu : les tissus (oreille, ganglion) sont prélevés chez des animaux euthanasiés à différents temps après l’infection. -Expériences d’imagerie intravitale de la muqueuse intestinale : la muqueuse intestinale est imagée chez des animaux infectés par gavage (inoculation de spores infectieuses par voie orale) et anesthésiés (durée : 2h, 1 intervention). Les animaux sont euthanasiés à la fin de l’expérience d’imagerie (temps 2-4h ou 24h).
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
* Expériences dans le modèle du pavillon de l’oreille : toutes les interventions sont réalisées sur animal anesthésié, ce qui évite tout stress, inconfort ou douleur chez l’animal. Les animaux sont pesés chaque jour après l’injection des spores dans l’oreille, et ce pendant toute la durée de l’expérience. Les expériences sont de courte durée (6 jours maximum) et la réponse inflammatoire observée localement au point d’injection est minime. Toute souffrance apparente de l’animal repérable en surveillance journalière : poil hérissé, baisse de la motricité, mènera cependant à l’arrêt immédiat de l’expérimentation avec euthanasie des animaux. * Expériences dans le modèle de la muqueuse intestinale : toute souffrance apparente de l’animal repérable en surveillance journalière après l’inoculation des spores d’E. cuniculi ou d’ E. intestinalis par gavage : poil hérissé, baisse de la motricité, conduira à l’arrêt immédiat de l’expérimentation avec euthanasie des animaux. Toutes les expériences d’imagerie intravitale de la muqueuse intestinale seront réalisées sur animal anesthésié, ce qui évite tout stress, inconfort ou douleur chez l’animal. L’animal est euthanasié à la fin de chaque expérience.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les animaux inoculés avec les spores d’E. cuniculi ou d’E. intestinalis sont gardés en vie (quelques heures ou quelques jours) en vue de l’imagerie de la muqueuse intestinale ou du tissu de l’oreille. A la fin de chaque session d’imagerie et ainsi à la fin du projet, tous les animaux sont euthanasiés en vue des prélèvements de tissus infectés (oreille, ganglion auriculaire, muqueuse intestinale).
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Notre approche expérimentale inclut une première analyse in vitro avec des lignées cellulaires et des cultures primaires de cellules immunitaires, mais elle reste largement insuffisante pour connaitre les interactions fines mises en jeu entre parasites et cellules immunitaires. En effet, elle n’englobe que très partiellement la complexité de la réponse immunitaire in vivo, à l’échelle tissulaire.
2. Réduction
Expériences de microscopie confocale dans le modèle du pavillon de l’oreille (expériences I) ou de la muqueuse intestinale : le nombre d’animaux par lot (n=1) a été défini selon la puissance statistique et la variabilité des paramètres étudiés. Dans le modèle de l’oreille, le même animal est suivi au cours de 6 points de cinétique différents (faible nombre d’animaux utilisés). Dans le modèle intestinal, l’expérience est de courte durée (observation soit au temps 2-4H, soit au temps 24h) et l’animal est euthanasié à la fin de chaque expérience. L’expérience est répétée 20 fois (modèle de l’oreille) ou 30 fois (modèle intestinal) car une grande variabilité de la réponse immunitaire peut être observée d’un individu à l’autre, et selon le modèle utilisé. Ce nombre est justifié par la variabilité des réponses in vivo dues à la variation de l’inoculum parasitaire et à une réponse immunitaire individuelle hétérogène. Une analyse statistique par Anova ou test de Student sera réalisée, une différence au niveau du recrutement cellulaire ou de la charge parasitaire sera généralement considérée comme statistiquement significative lorsque la P value sera inférieure à 0,05.
3. Raffinement
Les animaux sont stabulés dans une salle climatisée (22 ± 2°C) avec un cycle 12/12 h (jour/nuit, 7h00 à 19h00) et un taux d’humidité maintenu à 55%. Les animaux ont libre accès à la boisson et à la nourriture. Le régime alimentaire est composé de croquettes (A04-Safe, Epinay/Orge, France). Dans les deux modèles d’étude (modèle oreille, modèle intestinal), toutes les interventions sont réalisées sur animal anesthésié, ce qui évite tout stress, inconfort ou douleur chez l’animal. *Modèle du pavillon de l’oreille : Après imagerie du tissu de l’oreille et pendant la phase de réveil, l’animal est placé sur un tapis chauffant thermorégulé pour éviter l’hypothermie, et gardé en observation pendant 2 heures puis remis dans sa cage initiale si tout va bien (pas de poil hérissé, respiration régulière, recouvrement d’une motricité normale, alimentation normale). Les animaux sont pesés chaque jour après l’injection des spores dans l’oreille, et ce pendant toute la durée de l’expérience. Les expériences sont de courte durée (6 jours maximum) et la réponse inflammatoire observée localement au point d’injection est minime. Toute souffrance apparente de l’animal repérable en surveillance journalière : poil hérissé, baisse de la motricité, mènera cependant à l’arrêt immédiat de l’expérimentation avec euthanasie des animaux. Les biopsies de tissus seront toujours réalisées sur des animaux euthanasiés, après dislocation cervicale. Après vérification de la mort de l’animal par arrêt total, rapide et durable des mouvements cardio-respiratoires et par l’absence de réflexes (pincement de la patte), les tissus (oreille ou ganglion lymphatique) sont prélevés très rapidement. * Modèle de la muqueuse intestinale : le recours à l’anesthésie profonde permet d’éviter tout stress ou douleur chez l’animal. Les expériences sont de courte durée (quelques heures). L’animal est sacrifié après observation de la réponse inflammatoire au niveau du sommet des villosités intestinales (anses iléales).
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris est actuellement le modèle de vertébré couramment utilisé pour étudier in vivo la réponse immunitaire anti-microsporidie. Des souris C57BL6 mâles ou femelles de 8 à 12 semaines seront utilisées. Le poids (âge) choisi correspond à celui d’un jeune animal adulte qui a un système immunitaire mature. Les animaux seront utilisés à l’âge de 8 à 12 semaines, ce qui correspond à l’âge d’une souris possédant un système immunitaire mature.