Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 23/03/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-948708)
40 rats vont être utilisés, tous tués à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque animal reçoit dans la cheville une injection d’adjuvant de Freund qui déclenche une douleur inflammatoire chronique de six à huit semaines, avec boiterie et hypersensibilité, avant d’être tué au vingt et unième jour pour prélever son cerveau. Cette douleur chronique est provoquée non pour produire des connaissances mais pour fournir à des étudiants de licence un modèle sur lequel s’exercer à une technique d’immunohistochimie, durant deux jours de travaux pratiques. Le porteur suit les animaux par pesée quotidienne et mesure des articulations, et affirme qu’aucune méthode sans animaux ne remplace ce protocole, la douleur chronique impliquant selon lui de nombreuses régions du système nerveux.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Le projet concerne la production d’un modèle de douleur chronique inflammatoire qui sera utilisé par des étudiants en 3ème année de Licence ayant choisi de suivre le parcours « Neurosciences » lors d’une séance de 2 jours de travaux pratiques. Les étudiants ne sont pas chargés de la mise en œuvre du modèle animal en raison des impératifs de formation réglementaire. Sur les cerveaux de rats, ils évalueront l’impact d’une douleur chronique inflammatoire sur la neurogenèse adulte hippocampique (gyrus denté). Les étudiants seront formés à la technique d’immunohistochimie : coupe de cerveaux, révélation immunohistochimique, quantification de la neurogenèse. La technique d’immunohistochimie est largement utilisée en laboratoire de Neurosciences permettant de localiser des protéines à l’aide d’anticorps spécifiques. L’objectif est de leur permettre d’acquérir une connaissance pratique complémentaire de la connaissance théorique qu’ils ont en cours magistral (la neurogenèse, la douleur, les techniques expérimentales) et la conduite d’une technique d’expérimentation (révélation immunohistochimique) dans des conditions réglementaires de sécurité. Les données collectées chez l’animal durant ce TP seront remises en perspective par rapport aux données humaines existantes.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce modèle de douleur chronique inflammatoire induit une diminution de la neurogenèse hippocampique adulte. Ce projet permettra au étudiants d’acquérir une connaissance pratique complémentaire de la connaissance théorique qu’ils ont en cours magistral (la neurogenèse, la douleur, les techniques expérimentales) et la conduite d’une technique d’expérimentation (révélation immunohistochimique) dans des conditions réglementaires de sécurité.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les animaux modèles subiront une injection unique d’adjuvant de Freund complet (50µl) dans l’articulation de la cheville de la patte postérieure droite. L’injection se fera sous anesthésie à l’isoflurane (après un pré-traitement antalgique) et durera environ 5 minutes. Ils seront ensuite laissés 20 jours en stabulation , manipulés uniquement pour le suivi de l’inflammation et de leur état général, afin que la douleur chronique inflammatoire se développe. Le 20eme jour, ils subiront deux injections intrapéritonéale du marqueur de neurogenèse espacées de 2 heures. Les injections sont réalisées sur animal éveillé et sont très rapides (1 minute de contention au maximum). Le 21eme jours, l’ensemble des animaux (modèles et contrôles) sera anesthésié puis euthanasié par une méthode réglementaire et le cerveau sera ensuite prélevé (45 minutes).
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Suite à l’injection de l’Adjuvant Complet de Freund dans l’articulation de la cheville, les animaux développeront une douleur chronique inflammatoire. Le lendemain de l’injection, une réaction immunitaire va se développer, strictement localisée à la patte injectée. Cette réaction va s’accompagner d’une inflammation de la cheville, d’un gonflement et d’une rougeur modérés et d’une hypersensibilité qui dure de 6 à 8 semaines et qui débute le lendemain de l’injection. Durant la période de douleur chronique, la mobilité des animaux est légèrement diminuée (apparition d’une boiterie) mais pas de façon significative. Ceci entraine une tendance à la diminution du comportement exploratoire mais sans significativité. La mise en position debout est diminuée mais pas abolie, l’animal portant son poids sur la patte non inflammée. Le comportement de toilettage n’est pas modifié.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
L’euthanasie utilisée en fin de procédure pour l’ensemble des animaux est nécessaire 1/ pour pouvoir réaliser des coupes fines (50µm) d’hippocampe qui nécessitent un cerveau fixé et 2/ pour retirer l’ensemble des globules rouges du cerveau afin de réaliser la révélation immunohistochimique.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. Il est nécessaire de développer une douleur chronique car une douleur aiguë n’induit pas de modulation de la neurogenèse hippocampique adulte. Il est nécessaire de réaliser ce modèle in-vivo car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique.
2. Réduction
Les étudiants travailleront en binôme. 1 membre du binôme traitera le cerceau contrôle et l’autre membre traitera le cerveau modèle de douleur chronique (coupe et révélation immunohistochimique). Ils pourront ainsi comparer la quantification des cellules neo-formées entre les rats controles et modèles, à l’intérieur du binôme et entre les différents binômes. Chaque étudiants prélèvera 4 coupes frontales d’hippocampe de rat, à différents niveaux de l’hippocampe. De ce fait, au vu de la sélection d’étudiants pour ces unité d’enseignement, 1 cerveau contrôle et 1 cerveau modèle sont suffisants par groupe. Ils présenteront les résultats sous forme d’un mini article scientifique. Les résultats seront regroupés afin qu’ils puissent réaliser des analyses statistiques, mettre en forme et discuter les résultats obtenus. Sur 5 ans, 40 animaux maximum seront utilisés.
3. Raffinement
Durant toute leur période de présence à l’animalerie, l’état général des animaux sera très attentivement suivi. Les animaux seront observés et pesés quotidiennement. Le poids de référence de l’animal sera celui à J0. Une signalétique adaptée (étiquette de suivi post-opératoire) sera placée sur les cages. Un suivi particulier sera fait pour les animaux modèles de douleur inflammatoire chronique en s’attachant à leur état général et à l’aspect de la patte injectée. Ils feront l’objet de tests aux jours J0 (avant l’injection), J4, J8, J12, J16 et J20. Les tests incluront la mesure du diamètre des articulations (mesuré à l’aide d’un calibre à coulisse) et une évaluation clinique reposant sur l’évaluation de l’inflammation (points limites). Un soin particulier sera apporté à la limitation de toute souffrance non liée au modèle ainsi qu’à leur bien-être (enrichissement de l’environnement, paramètres environnementaux contrôlés tout au long de l’étude, habituation d’une semaine à la pièce de stabulation, litière souple). Des points limites précoces et spécifiques sont définis qui conduiront si nécessaire à l’interruption de l’expérimentation si les critères d’arrêt sont atteints. L’injection de l’agent inflammatoire se fera sous anesthésie générale avec un prétraitement antalgique. Pour l’acte terminal, les animaux recevront une injection d’antalgique suivi de l’injection du mélange anesthésique.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Ce projet pédagogique porte sur la modulation de la neurogenèse hippocampique chez le rat adulte. J’utiliserai donc des rats mâles Spague-Dawley âgés de 7 semaines, comme généralement utilisés par la communauté scientifique. Le choix du rat se justifie également au regard de la taille du cerveau et de l’hippocampe. L’étendue rostro-caudale de l’hippocampe est suffisante chez le rat pour que l’ensemble des étudiants d’un groupe puisse récupérer 4 coupes chez un seul animal (limitation du nombre d’animaux utilisé). Choix de la souche Sprague-Dawley : c’est un bon modèle car les animaux sont 1/naturellement peu stressés (le stress est un des meilleurs modulateurs de neurogenèse) et les marquages contrôles de la neurogenèse donnent d’excellents résultats reproductibles et 2/ répondent bien au développement de la douleur chronique inflammatoire garantissant une modulation de qualité de la neurogenèse.