Développement d’un nouveau modèle murin de la Dystrophie Myotonique de Type 1 : caractérisation physiologique et moléculaire du phénotype musculaire.

La Dystrophie Myotonique de type 1 (DM1) est une des maladies neuromusculaires les plus fréquentes chez l’adulte. Cette maladie est caractérisée par de multiples symptômes parmi lesquels des atteintes musculaires (faiblesse musculaire, myotonie), cardiaques et neurologiques particulièrement invalidantes. La mutation à l’origine de cette pathologie consiste en l’expansion de répétitions CTG dans la région 3’ non traduite du gène DMPK. Les ARNm DMPK mutants contenant ces répétitions pathologiques s’accumulent dans le noyau sous forme d’agrégats (foci) et séquestrent notamment les protéines de liaison aux ARNs de la famille MBNL. La perte fonctionnelle de MBNL altère la maturation de plusieurs ARNs et certaines anomalies ont été associées à des symptômes. Cependant, d’autres mécanismes semblent être impliquées dans cette maladie complexe. Il n’existe actuellement pas de traitement pour la DM1. L’étude des mécanismes moléculaires à l’origine de cette maladie multisystémique nécessite des modèles animaux reproduisant les principaux symptômes observés chez le patient DM1. Ces modèles sont également indispensables pour valider le développement de nouvelles thérapies. Il existe quelques modèles murins de la DM1 qui ont permis de grandes avancées mais qui présentent cependant de nombreuses limites et ne reproduisent qu’une partie des symptômes de la DM1. Le développement de nouveaux modèles murins présentant le plus de similitudes avec la pathologie humaine est donc un enjeu majeur. Les objectifs du projet sont: 1) la création d’un nouveau modèle murin (souris) de la Dystrophie Myotonique de type 1, spécifique du muscle et reproduisant plus fidèlement les principales anomalies physiologiques, histologiques et moléculaires observées chez l’homme que les modèles animaux décrits précédement 2) la validation de ce modèle et l’optimisation des conditions d’induction de la mutation 3) l’analyse physiologique, histologique et moléculaire du phénotype musculaire induit par la mutation à long et court terme chez les souris 4) l’analyse de la réversibilité du phénotype après arrêt de l’expression de l’ARN mutant afin de mimer l’effet des thérapies et d’examiner la capacité de récupération musculaire dans les approches thérapeutiques ciblant cette maladie.

Nous attendons de ce nouveau modèle murin une reproduction plus fidèle des défauts physiologiques, histologiques et moléculaires observés dans les muscles de patients DM1 que dans les autres modèles animaux décrits précédement. L’obtention et l’etude de ce nouveau modèle murin plus performant ouvrira la voie à une meilleure caractérisation des mécanismes moléculaires à l’origine de la pathologie et des conséquences physiologiques. Enfin l’utilisation de ce modèle devrait permettre de tester et de valider chez la souris le développement de nouvelles thérapies de traitement de la DM1 développées au laboratoire mais aussi par tous les laboratoires qui travaillent sur cette maladie.

Les 720 souris ce projet seront impliquées dans des procédures de sévérité légère, modéré et sans réveil. La première procédure P1, de séverité modérée, qui s’étale sur une période de temps de 1 à 8 mois et concerne 672 souris est le maintient d’une lignée d’animaux transgéniques suceptibles de développer des symptômes musculaires. La deuxième procédure P2, de séverité légère, concerne 48 souris et consiste a injecter l’inducteur doxycycline en injection intra-péritoneale et s’étale sur une durée de 4 jours. La troisième procédure P3 de séverité légère et réalisé 2 à 3 fois au cours l’experience concerne 576 souris et consiste en un prélevement sanguin au niveau du sinus retro-orbitale. Les procédures P4 (grip test) et P5 (rotarod) de séverité légères concerne 576 souris et consistent en des tests non invasifs de la fonction musculaire qui seront réalisés 2 à 3 fois au cours de l’experience (selon la phase). La procédure 6, sans réveil, concerne 576 souris et consiste en un test invasif de la fonction musculaire réalisé sous anesthésie dont l’issue est la mort de l’animal par dislocation cervicale afin de réaliser des prélevements musculaires.

Les symptômes ou effets attendus pendant ou à l’issue de la procédure P1 (classée modérée) sur les souris induites uniquement (cad ayant recu de l’inducteur: doxycycline) sont exclusivement musculaires compte tenu de la specificité d’expression de l’ARN mutant et sont: une myotonie, une atrophie, une faiblesse ou une fatiguabilité musculaire plus importante pouvant se traduire par des troubles de la mobilité et des difficultés respiratoires légers. Les effets indésirables attendus pendant les autres procédures P2, P3, P4, P5 sont classés légers et sont un stress léger lors des manipulations et test d’évaluation fonctionnelle non invasifs du muscle ou de l’ordre de la gène ressentie lors d’une piqure (injections de doxycycline ou d’anesthésique). La procédure d’analyse fonctionnelle et invasive du muscle P6 s’effectue entièrement sous anesthésie et est classée sans réveil. En l’absence de l’inducteur (doycycline) administré soit en injection péritonéale (sévérité légère) en phase 1 soit par après addition au régime alimentaire (en phase 2 et 3) les souris ne présenterons aucun symptômes.

En phase 1 étape 1, les 48 souris ne feront l’objet que d’une procédure (P2) et seront euthanisées le lendemain de la procédure pour réaliser des prélèvements de tissus musculaires nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires. En phase 1 étape 2, les 96 souris ne feront l’objet que d’une procédure (P1) et seront euthanisées a l’issue de la procédure pour réaliser des prélèvements de tissus musculaires nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires. En phase 2 et 3, après avoir été impliquées dans une succession de procédures P1, P3, P4, P5 et P6, les 576 souris seront euthanasiées après la procédure P6 (analyse fonctionnnelle du muscle) pour réaliser des prélèvements de tissus musculaires nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires

A ce jour, des modèles murins, drosophile et poisson-zèbres ont été décrit pour la DM1. Cependant tous ces modèles expriment soit des petites expansions CTG pures soit des expansions de triplets CTG interrompues différentes de la mutation humaine et ne reproduisent pas toutes les altérations physiologiques et moléculaires observées chez l’homme. Le seul modèle exprimant de grandes répétitions CTG est le modèle de souris DMSXL. Cependant l’expression musculaire du transgène chez la souris DMSXL adulte est faible et ne reproduit pas l’ensemble des anomalies présentent dans le muscle de patient DM1. Compte tenu de la complexité de manipulation de grandes répétions CTG pour la création de modèles, nous avons choisi de modifier le modèle murin DMSXL afin de produire au stade adulte, une quantité d’ARN mutants suffisante pour mimer le phénotype musculaire présent chez les patient DM1. Le développement d’un nouveau modèle murin est donc essentiel pour une meilleure compréhension de la physiopathologie et l’évaluation d’approches thérapeutiques pour la DM1. Au début des procédures les souris utilisées seront des souris sevrées et adultes âgées de 8 semaines. L’age des souris au début de l’expérience est justifié par la durée de l’expérience (>1 an) et par la nécessité que le développement musculaire soit achevé. En fonction des phases et de l’étude de l’impact du temps sur le phénotype les souris auront entre 2 et 15 mois lorsqu’elles seront euthanasiées pour les prélèvements.