Etude des voies de signalisation RAGE dans le syndrome sec oculaire

L’oeil sec est une pathologie de la surface oculaire, très fréquente, touchant environ 50 à 60 % des personnes de plus de 50 ans. Notre objectif est de caractériser le récepteur RAGE, ses voies cellulaires, et l’expression phénotypique du syndrome sec oculaire dans plusieurs tissus et fluides de l’oeil (cornée, conjonctive, cellules à mucus, larmes) ainsi qu’au niveau physiologique (développement de la maladie) chez des souris KO RAGE -/- et chez des souris « sauvages » soumises à des conditions environnementales connues pour être à risque de syndrome sec oculaire. La conduite de cette étude sur l’oeil sec in-vivo ne peut pas être menée directement chez le patient pour des raisons éthiques évidentes. Ainsi, celle-ci nécessite un organisme vivant, afin d’avoir une vue d’ensemble sur le développement de la maladie et sur les acteurs impliqués dans la survenue et le caractère cyclique de cette pathologie. Considérant la règle des 3R, nous ne pouvons pas recourir au remplacement du modèle animal décrit.

Le récepteur des produits avancés de glycation (RAGE) est un récepteur ubiquitaire dans l’organisme, connu pour être pro-inflammatoire, pro-thrombogène, ou encore pro-apoptotique au niveau cellulaire. Notre objectif est de caractériser le récepteur RAGE, ses voies cellulaires, et l’expression phénotypique du syndrome sec oculaire dans plusieurs tissus et fluides de l’oeil (cornée, conjonctive, cellules à mucus, larmes) ainsi qu’au niveau physiologique (développement de la maladie) chez des souris KO RAGE -/- et chez des souris « sauvages » soumises à des conditions environnementales connues pour être à risque de syndrome sec oculaire. Ainsi, nous essayons par ce projet de mieux connaitre les voies d’activation cellulaire de RAGE dans la pysiopathologie du syndrome sec oculaire. Un des bénéfice majeur de ce travail pourrait être une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques complexes du syndrome sec oculaire, notamment les voies d’activation de l’inflammation au niveau de la surface oculaire.

Des souris KO RAGE -/- et des souris « sauvages » RAGE +/+ de la lignée C57 Black 6 (âgées de 4 à 6 semaines) seront soumises à des stimuli environnementaux connus pour être à risque de survenue de sécheresse oculaire (comme une attention soutenue sur une tâche nécessitant de la concentration, et/ou une condition venteuse avec hygrométrie faible). En parallèle, des souris témoins des 2 fonds génétiques seront utilisés comme contrôle de l’expérimentation. Dans un premier temps, l’ensemble des souris seront placées dans leur cage en condition standard pendant 8 jours: température 23 +/- 2°C, humidité 50 à 75%, alternance 12 heures lumière – obscurité (8h to 20h), et eau/alimentation ad libitum. Pour les groupes « oeil sec », l’induction du syndrome se fera par l’injection sous-cutanée 4 fois par jour (8h00, 12h00, 14h00 et 17h00) de scopolamine (0.5 mg/0.2 ml; Sigma-Aldrich) en alternant le flanc gauche et droit. Les souris seront de plus exposées à un courant d’air continu à partir d’un ventilateur placé à 15 cm devant la cage (courant d’air de 2-4 m/secondes) dans une pièce à environnement contrôlé (30-35 % humidité, 23°C, alternance jour/nuit 12h) et ce pendant 10 heures par jour durant 12 jours consécutifs. Le modèle de maladie de l’oeil sec proposé dans ce projet a déjà largement été utilisé sans effet nocif perceptible lié au traitement à la scopolamine ni à une faible humidité [Luo, L. et al., 2004 ; Yeh, S. et al., 2003]. Pour les groupes témoins, les souris seront placées dans un environnement non stressant contenant 50 à 75% d’humidité à la température de 23 +/- 2°C, sans exposition à l’air forcé et eau/alimentation ad libitum. Lors de l’expérimentation, des tests « non invasifs » seront réalisés afin d’évaluer au jour le jour l’avancée du syndrome . Tout d’abord, la perte de production de larmes sera testée en utilisant des fils de coton imprégnés de rouge de phénol qui seront placés dans le ménisque des larmes du canthus latéral pendant 30 secondes (1 fois par jour pendant la durée de l’expérimentation). Ce test est considéré comme équivalent au test de Schirmer mené chez les patients souffrant d’un syndrome de l’oeil sec (bandelette buvard graduée permettant de quantifier la production lacrymale sur 5 minutes). En parallèle, l’étude de l’intégrité des épithéliums sera réalisée en utilisant l’instillation de fluorescéine (1%) et l’utilisation d’une lampe à fente (1 fois par jour pendant la durée de l’expérimentation).

La provocation expérimentale d’un oeil sec n’est pas anticipé comme étant une condition risquant de provoquer une douleur majeure ou une angoisse animale. Les symptômes de syndrome sec oculaire sont une sensation de corps étrangers, une brulure oculaire, une rougeur oculaire et une irritation de surface. Cependant, en cas de constation d’un comportement douloureux (intolérance majeure à la lumière, animal prostré, ne s’alimentant plus) ou d’un ulcère cornéen profond (stromal profond de la cornée) et/ou à risque de perforation cornéenne, l’animal sera anesthésié et sacrifié par surdosage en produits anesthésiques (Pentobarbital 150 mg/kg en injection intrapéritonéale), aboutissant à une apnée conduisant au décès. Ce type de symptômes ou constation clinique est exceptionnellement lié à un syndrome sec oculaire chez l’Homme. Ils sont le plus souvent dus à des commorbidités oculaires sous jacentes (pathologies inflammatoires, troubles liés à l’innervation cornéenne, anomalies des cellules souches limbiques, pathologies infectieuses cornéennes).

Tous les animaux sont sacrifiés avant prélèvement de leurs globes oculaires.

Comme évoqué dans les paragraphes précédents, le choix de la souris comme modèle d’étude va permettre : – une analyse biomoléculaire proche de la cornée humaine du fait de sa forte homologie anatomique et fonctionnelle avec l’espèce humaine. – l’utilisation du modèle murin dans le syndrome sec expérimental qui est d’ores et déjà largement décrit et reconnu au travers de la littérature. – d’utiliser les nombreux outils moléculaires accessibles, développés et validés dans le modèle murin ; et en particulier l’utilisation de souris dont le gène étudié (RAGE) est inactivé. Nous utiliserons des souris mâles Black 6 (souris « C57BL/6JRj, Janvier Labs ») âgées de 4 à 6 semaines. Ainsi toutes les souris ont le même poids et sont sevrées de l’allaitement maternel. C’est également la période optimum pour la cicatrisation des tissus.