Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 06/04/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-960176)
230 rats vont être utilisés, tous tués à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur induit une cirrhose par ligature chirurgicale du canal biliaire ou par injection d’un toxique hépatique, puis une infection bactérienne provoquée par injection de bactéries ou perforation de l’intestin, ce qui entraîne jaunisse et souffrances pouvant durer plusieurs semaines, pour tester un stimulant du système immunitaire. Le porteur indique arrêter l’étude au bout de neuf jours d’infection pour éviter le prolongement des souffrances. Il affirme que ce modèle animal est « incontournable » pour déterminer les doses avant des essais cliniques.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La cirrhose est une maladie du foie d’origine diverse (abus d’alcool, virus, obésité) qui entraine une défaillance du système de défense immunitaire, notamment des neutrophiles. Ces cellules représentent la plus grande famille des globules blancs du sang chez l’homme (50-60%) et jouent un rôle majeur dans l’élimination des bactéries. La défaillance des neutrophiles s’aggrave durant l’évolution de la maladie, ce qui augmente le risque d’infection bactérienne et de mortalité des patients, malgré le traitement de ces derniers par des médicaments antibiotiques. Ces médicaments sont généralement efficaces pour détruire la plupart des bactéries mais pas les bactéries « résistantes ». De plus, ils s’accumulent notamment dans les neutrophiles et inhibent leurs activités anti-bactériennes. Notre projet vise à corriger les défaillances d’activités antibactériennes des neutrophiles acquises au cours de la cirrhose, ce qui constitue une stratégie anti-infectieuse innovante. Elle est basée sur l’utilisation des molécules chimiques qui stimulent fortement les globules blancs. Des travaux invitro ont montré que ces molécules rétablissent efficacement l’activité anti-bactérienne des neutrophiles provenant de patients hospitalisés pour une cirrhose alcoolique sévère. De travaux préliminaires invivo chez des rats, confirment l’efficacité de ces molécules pour réduire l’infection bactérienne au cours de la cirrhose. Ce projet a pour objectif principal d’optimiser les conditions de traitement de l’infection bactérienne par ces molécules chimiques en recherchant notamment les doses thérapeutiques minimales. Les résultats attendus sont nécessaires pour mettre en place les premiers essais cliniques chez les patients ayant une cirrhose sévère, particulièrement ceux en attente de greffe de foie. Ils ouvrent également des perspectives originales en vue du traitement des infections par des bactéries résistantes aux antibiotiques. Ce projet utilisera un nombre réduit d’animaux (230 rats) sur une période de 4 ans, en respectant les principes fondamentaux de l’expérimentation animale. Les rats seront hébergés à raison de 2 animaux par cage avec un accès illimité à la nourriture et l’eau, dans un environnement enrichi pour apporter un confort maximal. Les opérations chirurgicales seront effectuées sous anesthésie générale avec un traitement analgésique pour prévenir les douleurs post-opératoires.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Les résultats préliminaires obtenus chez des rats ayant une cirrhose ont montré que les molécules chimiques qui stimulent fortement le système immunitaire permettent de réduire fortement le taux de mortalité des animaux infectés tout en corrigeant la défaillance de l’activité antibactérienne des neutrophiles acquises au cours de la cirrhose. Ce projet permettra de connaitre l’ensemble des doses thérapeutiques de ces agents stimulants, particulièrement les doses minimales. Ceci permettra d’initier sereinement les essais pré-cliniques chez les patients hospitalisés, de renforcer ainsi leur système immunitaire et de traiter les infections bactériennes en absence d’antibiotiques, y compris avec les bactéries « résistantes » aux antibiotiques. Ces effets bénéfiques devraient permettre de freiner l’évolution de la cirrhose vers ses formes plus sévères qui conduisent à des défaillances d’organes et au cancer. Il permettra ainsi d’améliorer l’état de santé des milliers de patients en attente de greffe de foie.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les animaux subissent une première étape d’induction de la cirrhose effectuée au jour zéro ( J0) par une opération chirurgicale consistant à sectionner le canal biliaire, après ouverture de l’abdomen. Cette étape est réalisée sous anesthésie générale et dure environ 15 minutes. Une deuxième méthode d’induction de la cirrhose, sans opération chirurgicale, est prévue; l’injection dans l’abdomen d’une substance chimique toxique pour le foie (2 injections par semaine jusqu’à J20). D’autres groupes d’animaux cirrhotiques subissent une infection déclenchée à J20 soit par injection dans l’abdomen de bactéries vivantes, soit par perforation de la partie initiale du gros intestin (caecum) après ouverture de la cavité abdominale. Cette opération est effectuée sous anesthésie et dure environ 15 minutes. Une partie des animaux infectés sont traités par injection de substances chimiques destinées à stimuler le système immunitaire. Des prélèvements de petits volumes de sang (100-250µl) sont effectués sur animaux à J0, puis à J15 et J20 pour les sous-groupes d’animaux non infectés. Pour les sous-groupes d’animaux infectés, 3 prélèvements sont effectués à J20, J21 et J22. Chaque animal subit ainsi au maximum 3 prélèvements effectués à différents endroits; à l’extrémité de la queue (par coupure) et à l’aide d’une micro-seringue au niveau de veine de la patte et de la queue. Ces prélèvements servent à vérifier différentes modifications pathologiques induites au cours de la cirrhose comme l’augmentation de la quantité de globules blancs dans le sang, les défaillances d’activités anti-bactériennes des globules blancs mesurées notamment par la production de agents antibactériens, et le taux de protéines directement impliquées dans la destruction des bactéries.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Des effets indésirables sont attendus dès le début de l’étape d’induction de la cirrhose « BDL » à J0 car elle nécessite l’ouverture de l’abdomen puis la ligature et coupure du canal biliaire. Cette opération génère des douleurs et un risque d’infection bactérienne. Les animaux perdent un peu de poids (
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les infections bactériennes aigües induites sont susceptibles de générer des souffrances pendant plusieurs semaines. Pour éviter le prolongement des souffrances, l’étude sera arrêtée au bout de 9 jours d’infection des animaux, ce qui est suffisant pour atteindre l’objectif de l’étude et tous les animaux infectés seront euthanasiés
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
La capacité des stimulants du système immunitaire à corriger les défaillances des neutrophiles a déja été montrée dans des expériences «in vitro » avec des cellules provenant de patients ayant une cirrhose. A ce stade du projet, le modèle de cirrhose chez l’animal vivant est nécessaire car il reproduit les réponses inflammatoires pathologiques complexes conduisant à la perte des fonctions anti-infectieuses des globules blancs, comme celles observées au cours de la cirrhose humaine. Ce modèle animal est donc incontournable pour la détermination précise de la gamme des doses thérapeutiques du candidat-médicament en vue de futurs essais cliniques chez les patients hospitalisés, et patients en attente de greffe de foie.
2. Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au maximum tout en préservant les minima nécessaires pour les analyses statistiques des résultats entre les différents sous-groupes d’animaux, et en tenant compte du taux de mortalité élevé, particulièrement dans les deux modèles d’infection bactérienne aigüe (injection de bactéries purifiées dans l’abdomen, et perforation du caecum).
3. Raffinement
Tout au long de l’expérimentation, les procédures seront appliquées dans un souci permanent de préserver le bien-être animal et réduisant au maximum le stress, douleurs et souffrances occasionnés. Les opérations chirurgicales sont effectuées sous anesthésie générale. Un traitement anti-douleur sera appliqué juste avant l’opération chirurgicale pour l’induction de la cirrhose à J0 et pendant les 3 jours suivants. Les animaux seront remis dans leur cage sous lampe chauffante jusqu’au réveil (2 animaux par cage) et surveillés minutieusement tous les jours pendant la première semaine puis tous les 2 jours. Dès le déclenchement de l’infection bactérienne à J21, des traitements non médicamenteux seront appliqués. Les animaux seront surveillés 2 fois par jour et des aliments humidifiés et un biberon d’eau seront déposés à l’intérieur de la cage à proximité des animaux afin qu’ils puissent s’alimenter sans faire d’effort. Au besoin, les rats seront réhydratés et alimentés manuellement à l’aide d’une sonde de gavage en vue de minimiser la perte de poids post-infection ou chirurgicale. Des mesures de poids des animaux et de température seront effectuées en vue d’examiner des signes de souffrance, et signes cliniques plus précoces que l’état moribond et prédictifs de la mortalité. En cas de signes de souffrance intense, les animaux seront euthanasiés. Enfin, tous les animaux infectés survivants après une courte période d’infection (9 jours) seront euthanasiés afin de ne pas prolonger d’éventuelles souffrances susceptibles de persister pendant plusieurs semaines.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le modèle de cirrhose chez le rat est bien établi depuis une trentaine d’années pour la méthode par ligature/section du canal biliaire et pour l’induction avec les agants chimiques toxiques pour le foie. Les dégâts induits au niveau du foie (lésions) sont proches de ceux de la cirrhose humaine. Chez la souris en revanche, les lésions du foie induites sont plus proches de la fibrose (état pathologique du foie qui précède l’état cirrhotique), ce qui justifie le choix du rat. Les rats sont âgés de 4 à 6 semaines et considérés comme adultes, et la maturité de leurs systèmes de défense immunitaire est confirmée dans de nombreux nombreux travaux publiés.