Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 2023-04-21 00:00:00
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-348973)
874 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dont 330 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont infectées une fois par le parasite Toxoplasma gondii, puis tuées à un moment donné pour prélever le foie, la rate et le cerveau. Le porteur indique que 15 à 20 % des souris peuvent développer une forme aiguë avec tremblements, poil hérissé et abdomen distendu, et prévoit une euthanasie dès les premiers signes. Il décrit la souris comme un « modèle incontournable », hôte naturel du parasite, qu’il n’a pas été possible de remplacer par des tests in vitro.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Note de l'OXA. Cette question est celle du formulaire européen de résumé non technique. Elle est posée au laboratoire qui demande l'autorisation, et sa réponse est écrite avant que la première procédure commence (arrêté du 1er février 2013, art. 5). Ces objectifs servent à justifier l'utilisation des animaux devant le comité d'éthique. Aucun document public ne dira ensuite s'ils ont été atteints : la directive permet aux États de faire mettre à jour le résumé avec les résultats de l'appréciation rétrospective (directive 2010/63/UE, art. 43), la base européenne prévoit de les recevoir, et aucune entrée française n'en porte (base ALURES).
Toxoplasma gondii est un modèle pertinent pour l’étude des mécanismes impliqués dans la virulence des parasites apicomplexes, qui incluent Plasmodium, agent de la Malaria. Nos recherches sur les mécanismes assurant la dissémination et la survie du parasite au sein de son hôte pourront servir à long terme à développer de nouvelles stratégies thérapeutiques contre les parasites de ce phylum. De plus, la toxoplasmose chronique est responsable d’encéphalites aigües lors de la réactivation des formes kystiques latentes présentes dans le cerveau des individus infectés souffrant d’immunodépression. Ainsi, l’étude des mécanismes régulant les interactions entre le parasite et le système immunitaire de l’hôte permettra de lutter contre l’établissement de la toxoplasmose cérébrale latente pour laquelle il n’existe actuellement aucun traitement. Préalablement aux expériences sur l’animal, des expériences menées in vitro ont permis de démontrer que l’infection par T. gondii stimule l’induction de la réponse UPR dans des cellules dendritiques. Par la suite, dans les souris, nous avons pu démontrer l’activation de la voie IRE1 de l’UPR dans les cellules dendritiques conventionnelles de type 1 (cDC1) lors de l’infection et que cette activation est essentielle pour monter une immunité protectrice contrôlant la dissémination parasitaire. Cependant, il reste à identifier par quels mécanismes la voie IRE1 stimule les fonctions des cDC1. En particulier, nous nous intéressons à la régulation par la voie IRE1 de l’activité de présentation antigénique sur les molécules CMH-I des cDC1, un processus nécessaire à l’activation des lymphocytes T spécifiques, amenant une protection à long terme contre une ré-infection, ainsi que le contrôle de la toxoplasmose chronique cérébrale. D’autre part, l’évaluation de la pathogénicité de certaines souches parasitaires mutantes peut aider à développer de nouvelles stratégies de vaccination contre cette infection, pour laquelle aucun vaccin n’est disponible chez l’Homme. En cela, nos recherches nécessitent des modèles in vivo pertinents qu’il n’a pas été possible jusqu’ici de remplacer par des tests in vitro.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Note de l'OXA. Le formulaire européen demande les bénéfices « susceptibles de découler » du projet. Il appelle donc une projection, et il l'obtient : ce que le laboratoire écrit ici est ce qu'il espère, avant d'avoir commencé. Deux chercheuses ont repris six corpus d'études précliniques déjà menées et pesé les dommages réellement infligés aux animaux contre les bénéfices cliniques réellement obtenus : moins de 7 % de ces études ressortaient défendables (Pound et Nicol, 2018).
Des études ont montré que l’induction de la voie IRE1 dans les cellules dendritiques est essentielle à la mise en place d’une réponse immunitaire protectrice contre certaines infections bactériennes et parasitaires par l’induction d’une réponse efficcace des Lymphocytes T (LT). Découvrir les mécanismes moléculaires sous-jacents permettra de proposer des thérapies ciblées visant à booster l’activation des LT spécifiques et bloquer l’installation de la toxplasmose latente cérébrale, pour laquelle il n’existe aucun traitements. Nos découvertes pourront également s’appliquer à d’autres agents infectieux comme Mycobactérium (agent de la tuberculose) et des virus respiratoires, qui ont été démontrés comme activant la voie IRE1 dans les cellules dendritiques lors d’une infection. D’autre part, l’évaluation de la pathogénicité de certaines souches parasitaires mutantes peut aider à développer de nouvelles stratégies de vaccination contre la toxoplasmose.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Note de l'OXA. La formule « en règle générale » autorise une réponse générale, et c'est l'un des points sur lesquels les examens de qualité trouvent ces documents défaillants. Cruelty Free International a établi en 2018 que les résumés allemands et britanniques, les seuls examinés à ce jour, décrivaient mal ce qui est fait aux animaux et ce que ceux-ci pourraient éprouver (Taylor et al., 2018). L'adoption d'un modèle commun européen a nettement amélioré le premier point, à peine le second (Taylor et al., 2024).
L’infection des souris est réalisée une seule fois en début d’expérience par injection intrapéritonéale d’une faible dose de parasites. Les prélèvements sont effectués post-mortem à un temps donné de l’infection, représentant la fin du protocole expérimental. Le foie, la rate, le cerveau sont prélevés ainsi que 100µL de sang par ponction cardiaque. Les souris ne reçoivent aucun traitement ou manipulation avant euthanasie.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Note de l'OXA. C'est l'endroit du document où les animaux devraient apparaître, et c'est celui qui résiste. Cruelty Free Europe a mesuré en 2024 que cinq des six éléments attendus sur les dommages prévus progressaient depuis l'adoption d'un modèle commun européen. Les effets indésirables sont le sixième : 41 % des résumés allemands et 48 % des britanniques les décrivent complètement. Les auteurs relèvent aussi des effets présentés comme minimes sur des projets classés modérés ou sévères (Taylor et al., 2024). Ces deux pays sont les seuls dont les résumés ont été examinés. Les résumés français relèvent du même modèle européen, et leur qualité n'a jamais été mesurée.
Les souris sont infectées une seule fois par voie intra-péritonéale en début de protocole expérimental et ne sont soumises à aucun prélèvement. Le prélèvement des organes/sang ne se fait qu’après la mise à mort en fin de protocol expérimental. Les souris infectées par la souche parasitaire PRU sont euthanasiées 6 jours post-infection dans la majorité des procédures expérimentales, avant le développement de symptômes cliniques pouvant entrainer une souffrance de l’animal. Pour le modèle de la toxoplasmose chronique, les souris seront sacrifiées 3 semaines post-infection, mais à ce stade, elles ne développent aucun signe clinique, cette forme de toxoplasmose étant bégnine (certains symptômes neurologiques de changements comportementaux peuvent se développer à partir de 3 mois d’infection). Cependant, certaines souris peuvent développer (dans 15 à 20% des cas) une toxoplasmose aïgue (Jours 9-14 post-infection) corrélée à des changements de comportement : tremblement, diminution de l’exploration, et/ou d’aspect physique externe : poil hérissé, abdomen distendu. Les souris sont surveillées quotidiennement après l’infection et l’apparition de signes précoces de souffrance (point limite fixé est quantifié par une grille de score) entrainera leur euthanasie immédiate.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Note de l'OXA. Le formulaire demande de justifier ce sort, non de le décrire. L'analyse dommage-avantage que la directive impose au comité d'éthique porte sur « la souffrance, la douleur et l'angoisse » infligées aux animaux (directive 2010/63/UE, art. 38). Quand ce sort est la mise à mort, celle-ci ne figure donc pas parmi les dommages que le comité met en balance avec les bénéfices annoncés. L'OXA écrit « mise à mort » plutôt que « sacrifice », qui emprunte au registre du don consenti, ou « euthanasie », qui désigne une mort décidée dans l'intérêt de celui qui meurt.
Afin d’évaluer la réponse immunitaire des souris infectées ainsi que la dissémination parasitaire, nos procédures impliquent le prélèvement d’organes vitaux comme la rate, le foie et le cerveau. Les animaux doivent donc être euthanasiés avant prélèvement et analyse de ces paramètres. De manière similaire, la génération de cellules dendritiques primaires à partir de la moëlle osseuse requiert le prélèvement des tibias et fémurs de la souris et ne peut donc se faire qu’après euthanasie de l’animal.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Note de l'OXA. La directive demande au résumé « une démonstration de la conformité » aux exigences de remplacement, de réduction et de raffinement (directive 2010/63/UE, art. 43). C'est donc le demandeur qui démontre sa propre conformité, dans le document même qui sollicite l'autorisation. Cette démonstration peut prendre la forme d'une affirmation qu'aucune méthode de substitution n'existe, que le document n'a pas à sourcer. Ces trois exigences sont par ailleurs subordonnées à l'objectif du projet : elles cherchent à remplacer les animaux dans un projet donné, elles n'interrogent pas ce projet.
A ce jour, aucun système in vitro ne permet d’englober tous les aspects de l’interaction hôte-pathogène qui aboutissent à la toxoplasmose aigüe ou cérébrale chronique, caractérisée par l’installation de kystes latents dans le cerveau qui sont résistants aux traitements antibiotiques existants. De plus, l’évaluation de la pathogénicité de certaines souches parasitaires mutantes peut aider à développer de nouvelles stratégies de vaccination contre cette infection. En cela, nos recherches nécessitent des modèles in vivo pertinents qu’il n’a pas été possible jusqu’ici de remplacer par des tests in vitro. De nombreux aspects de la pathogénicité étant comparables entre l’Homme et la souris, il est admis que la souris constitue un modèle incontournable pour le suivi de la réplication du parasite in vivo et l’étude des interactions avec le système immunitaire de l’hôte. Par ailleurs, les différentes stratégies innovantes de lutte contre le parasite peuvent être évaluées et validées chez la souris qui est un modèle naturel d’infection et développe une toxoplasmose aigüe et chronique, similaires à ce qui est observé chez l’Homme. Par ailleurs, nous analysons la modulation de la réponse UPR (Unfolded Protein Response) au stress infectieux dans les cellules dendritiques, une réponse qui permet la mise en place d’une réponse immunitaire efficace contre le parasite. Nos résultats préliminaires montrent un impact de la réponse UPR sur la prolifération d’un sous-type de DC spléniques. Pour ces raisons, notre projet nécessite de réaliser nos études dans des cellules primaires et non des lignées cellulaires immortalisées, qui ont un cyle de division modifié. Cependant, nous utilisons une lignée de cellules dendritiques cDC1 immortalisée (MuTuDC) afin de valider certaines de nos hypothèses mécanistiques avant de les tester sur des cellules primaires issues de souris ou dans la souris, et d’étudier leur impact sur la dissémination parasitaire et la mise en place d’une immunité mémoire.
2. Réduction
Note de l'OXA. La réduction dont il est question ici porte sur le nombre d'animaux par groupe expérimental, calculé pour que l'analyse statistique tienne. Le total annoncé dans la fiche est une estimation portant sur une autorisation de cinq ans au maximum (code rural, art. R214-123) : il ne dit pas combien d'animaux seront effectivement utilisés, et il ne se rapporte pas à une année.
Afin de minimiser le nombre de souris utilisées, l’analyse de nombreux paramètres se fait simultanément sur une même souris après prélèvement des différents organes (rate, foie, cerveau, sang). Les expériences sont répétées 3 fois et chaque expérience (3-7 souris par groupe expérimental) est analysée de manière indépendante. Ces conditions nous permettent de vérifier la reproductibilité des observations et de générer des résultats statistiquement validés. Notre connaissance préalable des protocoles expérimentaux utilisés ainsi qu’une étude statistique adaptée nous permet d’assurer la fiabilité du résultat tout en limitant à son minimum le nombre d’animaux utilisés.
3. Raffinement
Note de l'OXA. Le raffinement nomme une amélioration technique de la procédure, sans dire ce qu'elle change pour l'animal qui la subit. La réglementation impose d'atténuer la douleur, dans une limite qu'elle inscrit elle-même : « pour autant que cela soit compatible avec la finalité de la procédure expérimentale » (code rural, art. R214-109). Ce qui reste de souffrance après cette limite est autorisé. Le raffinement ne porte par ailleurs que sur la procédure : les souffrances de la captivité elle-même, confinement, bruit, lumière, manipulations d'entretien, ne relèvent d'aucun des trois R.
Différentes mesures sont prises pour réduire le stress, l’inconfort et la douleur pendant l’expérience : les animaux manipulés sont isolés dans une pièce séparée afin d’éviter tout stress aux animaux non manipulés ; les souris ne sont pas soumises à des traitements ou prélèvements répétitifs mais à un prélèvement unique après euthanasie. De plus, après infection, les animaux sont surveillés quotidiennement afin de détecter les signes éventuels de souffrance le plus tôt possible. L’obtention du point limite fixé, caractérisé par un changement de comportement : diminution de l’exploration, ou d’aspect physique externe : poil hérissé, abdomen distendu, entrainera l’euthanasie immédiate de l’animal . Les animaux sont maintenus dans les conditions standart de température, cycle lumière/obscurité, d’alimentation et la cage possède un enrichissement (maison en dur).
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Note de l'OXA. Le dossier d'autorisation demande de justifier l'origine des animaux, leur espèce, leur nombre estimé et leur stade de développement (arrêté du 1er février 2013, art. 5). La justification attendue est technique : elle porte sur l'adéquation de l'espèce à l'objectif poursuivi. Ce que l'appartenance à une espèce autorise à faire subir à un individu est une question morale, et le formulaire ne la pose pas. L'appartenance à une espèce, prise seule, ne fonde pourtant pas de différence de statut moral entre des individus également capables de souffrir.
La souris est un modèle pertinent d’étude car il est un hôte naturel de T. gondii qui inclut 1) La possibilité d’induction d’une toxoplasmose aigüe et chronique chez la souris par des souches de T. gondii infectant l’Homme et la pertinence de ce modèle expérimental en ce qui concerne l’évolution de la maladie, 2) Les nombreuses connaissances et outils disponibles pour cette espèce. En particulier, de nombreux anticorps contre des cytokines, chimiokines, voies de signalisation pro-inflammatoires assurent la réalisation d’expériences clés pour l’étude de la réponse immunitaire. Aussi, l’existence de LT CD8+ reconnaissant spécifiquement des antigènes de T. gondii sur les cDC murines permettent l’étude de l’activité de présentation antigénique. Ces paramètres font de ce modèle expérimental un système de choix qui permet d’éviter le recours aux espèces plus sensibles.