Biodistribution et suivi pharmacologique de vecteurs conjugués VHH chez la souris

Les neuropathies, myopathies, et maladies rares font partie des causes majeures de handicaps sévères dans le monde. A l’heure actuelle, les besoins médicaux actuels restent malheureusement très insatisfaits, sans aucuns traitements curatifs, ou palliatifs. Les maladies neurodégénératives telles qu’Alzheimer ou démences associées, les maladies lysosomales, les myopathies (Duchenne) sont des exemples d’enjeux de santé publique. C’est dans ce contexte scientifique que notre société a développé un savoir-faire qui consiste en la conjugaison de vecteurs (peptides) à des pro-drogues ou médicaments capables de passer les barrières physiologiques naturelle et dons d’atteindre plus efficacement les tissus cibles (cerveau, muscles…). En effet, la plupart de ces médicaments restent inefficaces par manque de passage et d’accès aux régions ou organes à traiter. L’objectif principal de notre société sera donc de proposer de nouvelles formulations capables de reconnaitre leurs partenaires naturels spécifiques, au niveau des barrières cellulaires protectrices de l’organisme et d’utiliser leurs mécanismes naturels de passage cellulaire pour atteindre le tissu cible. Par cette technique du cheval de Troie, nous faciliterons le passage de médicaments à travers la Barrière Hématoencéphalique (BHE) vers le système nerveux central (SNC). A travers cette demande de projet nous souhaitons développer et optimiser nos « vecteurs » (VHH) pour améliorer la délivrance d’agents au fort potentiel thérapeutique. Par des approches systémiques, en administrations intra-veineuses ou dermiques, en sous cutanées, nous tenterons d’améliorer le potentiel d’actions de nos vecteur-médicaments, sur une lignée murine de fond consanguin, génétiquement modifiée et humanisée pour le récepteur cible de ce projet.

> Choix d’une lignée murine « Humanisée » pour le récepteur : La transposition de nos recherches sur un modèle murin, aux récepteurs humanisés, permet d’appréhender les futurs développements pré-cliniques de nos molécules et les possibles effets secondaires ou toxicités associées. De plus, elle assure de développer au maximum les études sur le modèle souris avant la phase préclinique et la transposition à l’homme, qui aurait nécessité des séries de tests sur divers modèles animaux. Enfin, le fait de pouvoir humaniser notre cible endogène chez la souris constitue un excellent outil stratégique et scientifique, se traduisant par une réduction importante du nombre d’animaux au sein des études, par un gain de temps considérable (et donc économique), tout en réduisant par la suite de potentiels essais sur modèles animaux plus gros. D’un point de vue médical, sur du plus long terme, le potentiel de ciblage thérapeutique de nos Vecteurs médicaments (VHH) constitue l’objectif majeur de nos recherches, avec à terme, un bénéfice attendu qui pourrait permettre des avancées majeures en validant sur un modèle souris pathologique, puis à terme, dans le milieu médical et sur le quotidien des patients.

Cette procédure ne présente pas d’anesthésie, pas d’analgésie, ni de chirurgie avec réveil. Les manipulations expérimentales, sur animaux vigiles, (Pesées, intraveineuses ou sous-cutanées, prélèvements intermédiaires de sang) seront précises et rapides (≤ 2min). • Posologie : Les pesées (calculs posologies), annotations queues des souris (marqueur spécifique pour animaux), et l’ensemble des gestes à suivre seront réalisés par le même expérimentateur. En cas de procédure à doses répétées (≥ 24h), une pesée sera systématiquement effectuée avant chaque administration. • Administrations de VHH : Les administrations se font sur animaux vigiles au niveau caudal pour les intraveineuses, à la base du crâne (nuque), pour les sous-cutanée. Pour les administrations répétées (x3 maximum), un délai de minimum 24 à 48h sera respecté entre deux administrations. • Prélèvements intermédiaires : Des prélèvements sanguins intermédiaires seront réalisés en cours de cinétique, à différents « time points » sur animaux vigiles en contention spécialisée. Par une micro-incision de l’extrémité caudale, 3 à 5 gouttes de sang (≤50μl) suffiront pour quantifier la 1/2 vie plasmatique de nos VHH. Ces prélèvements de sang se feront aux temps intermédiaires de 4h, 24h, 72h ou encore 168h, en fonction des groupes, contrôles et VHH.

Dans ce projet nous chercherons à limiter au maximum le stress induit aux animaux. Ainsi, nous ne modifierons pas leur quotidien (cycles) et garderons les mêmes cages et aliments (absence de faim). Les animaux seront groupés par 4, ce, dès leur réception par les animaliers (absence isolement). Une salle spécifique servira de stabulation lors des cinétiques, elle présentera les mêmes conditions de vie qu’en hébergement. Dans ce projet, il n’y aura pas d’anesthésie, pas d’analgésie, ni d’intervention chirurgicale avec réveil (absence douleur, lésions). Les administrations, précises et rapides, se feront sur animaux vigiles et tenus en contention pour les intraveineuses (réduction stress et peur). De plus, nous proposons d’étudier nos VHH sur des temps d’incubations majoritairement courts. Certaines cinétiques pourront être élargies à 1 ou encore maximum 3 mois, en fonction du délai d’action pharmacologique. Si on se fie aux données de la littérature et notre expertise, les cinétiques d’incubations de quelques semaines à 3 mois ne suffisent pas pour générer des effets indésirables ou engendrer des conséquences physiologiques. En effet, les conjugués administrés présentent des demi-vies dites « relativement courtes », de quelques heures à quelques jours, seuls les effets cibles pharmacologiques de nos médicaments optimisés peuvent nécessiter des cinétiques plus longues avant d’en mesurer pleinement leurs efficacités. Ici, post-administration, le principal risque se trouve être la réaction immunitaire (choc anaphylactique), ainsi que d’autres effets indésirables (réaction allergique ; détresse cardio-respiratoire ; modification et troubles comportementaux). Mais là encore, ces problématiques sont étudiées en amonts et en post-expérimentales (immunogénicité) couplées à de la littérature et le savoir de nos experts en chimie et pharmacologie. Nos composés VHH administrés aux souris ne doivent pas présenter de toxicité, il en va de l’intérêts des animaux mais aussi de l’étude. Malgré ces précautions, une observation comportementale des animaux sera faite de manière quotidienne, à la recherche du moindre signe de souffrance, le tout accompagné d’un suivit du poids, du début des administrations à la fin des cinétiques, afin de s’assurer que les animaux ne perdent pas plus de 10% de poids initial.

En fin de procédure, tous les animaux seront euthanasiés pour réaliser les prélèvements tissulaires en point final. Si, entre temps, en cours de cinétique, un individu atteint un point limite, l’animal sera également euthanasié en urgence après validation du vétérinaire et porteur de projet.

Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d’utilisation et d’élevage, et idéale pour la mise en place de premières études précliniques. Le développement préclinique nécessite tôt ou tard une première approche in vivo, sur un modèle animal tel que le rongeur, dans notre cas, la souris. C’est le modèle le plus standardisé et utilisé en expérimentation animale, car sa physiologie, bien connue (mammifère), est relativement proche de l’homme. Le modèle rongeur facilite les manipulations, les injections et observations comportementales. Il est aussi plus adapté et intéressant pour la partie pharmacologie (diminution des posologies). En pratique, on l’utilise principalement pour la facilité de mise en place des expérimentations et l’obtention de groupes allant jusqu’à 4-5 individus sans trop de contraintes de stabulation. Notre modèle souris humanisé est particulièrement avantageux dans notre projet car il présente l’avantage d’avoir notre cible endogène humanisée (récepteurs). Les données obtenues sur ce modèle permettront notamment une extrapolation plus pertinente au modèle humain, d’envisager un gain de temps dans le développement futur du projet, mais aussi, d’éviter un certain nombre d’études et une utilisation significative d’animaux. Les animaux seront utilisés pour réaliser des suivis pharmacologiques, des échantillonnages de tissus, organes ou liquides physiologiques, ceci à des fins scientifiques. Pour notre procédure, nous utiliserons des animaux dits « jeunes adultes », ayant une moyenne de 8 à 12 semaines. A cet âge, nous limitons ainsi les variations inter individus qui peuvent avoir un impact sur les mécanismes physiologiques et les modulations de l’expression de certaines protéines. Ce stade « jeune adulte » présente un poids moyen de 25-27g environ, ce qui s’avère plus intéressant en termes de posologies (réduction des doses).