Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 26/04/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-594833)
168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par la bactérie Klebsiella pneumoniae, par voie nasale sous anesthésie ou par gavage, reçoivent un inhibiteur de l’inflammasome, puis sont tuées au cinquième jour pour prélever poumons, intestins, foie, rate et sang. Le porteur indique que l’infection pulmonaire peut provoquer sifflements, écoulements nasaux, insuffisance respiratoire et fièvre, les souris perdant 20 % de leur poids étant mises à mort. Il reconnaît avoir mené des essais in vitro sur cellules mais les juge insuffisants, et conclut à la nécessité d’un organisme complexe.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’axe intestin-poumons résulte d’une communication croisée entre le microbiote intestinal et la sphère pulmonaire. La survenue d’une dysbiose intestinale favorise un état d’hyper-inflammation, exacerbe les lésions pulmonaires et aggrave les pathologies respiratoires. Les mécanismes sous-jacents sont méconnus, et notamment les liens entre microbiotes et les complexes protéiques de l’immunité innée que sont les inflammasomes qui ont été identifiés comme de puissants modulateurs de l’inflammation. L’ambition de ce projet est de décrypter le rôle de l’inflammasome en lien avec l’interface hôte/microbiote dans l’axe intestin-poumons via un modèle infectieux impliquant le pathogène respiratoire Klebsiella pneumoniae (bactérie opportuniste commensale de l’intestin). Les objectifs sont d’identifier 1) s’il existe une activation differentielle de l’inflammasome dans le tissu pulmonaire et/ou intestinal chez des souris infectées par K. pneumoniae et 2) les conséquences de son activation (ou inhibition) sur le transfert d’informations immunologiques et bactériennes dans l’axe intestin-poumons. Pour cela, deux modèles murins seront développés: un modèle intestinale (modèle de colonisation intestinale par inoculation intra-gastrique de K.pneumoniae) et un modèle pulmonaire (instillation intra-nasale de K. pneumoniae). Dans les deux modèles, un inhibiteur de l’inflammasome sera administré afin d’étudier l’impact de l’inflammasome dans l’inflammation intestinale, pulmonaire et dans l’axe intestin-poumons. Les connaissances générées permettront d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour une approche spécifique du traitement des pathologies pulmonaires.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet a deux effets levier majeurs. Le premier est clinique, puisque le projet a pour objectif d’identifier le rôle des inflammasomes dans l’axe intestin-poumons et ainsi de générer des nouvelles pistes diagnostiques et/ou thérapeutiques. L’identification de bactéries commensales immunomodulatrices permettra le développement de bactéries probiotiques ou d’interventions nutritionnelles ciblées chez des patients atteints de pathologies respiratoires infectieuses et/ou inflammatoires. Ce projet vise également à décrire les interactions du microbiote intestinal avec les poumons en réponse à un pathogène. Ce domaine est encore largement méconnu mais il représente un levier majeur pour améliorer les connaissances sur la pathogénie, la persistance et la transmission des pathogènes. Ainsi, les données acquises lors de ce projet permettront d’initier un programme de plus grande envergure qui pourra faire l’objet d’un dépôt dans le cadre d’appels à projets nationaux.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Deux modèles d’infection avec le pathogène bactérien seront mis en place pendant 5 jours. Le premier modèle expérimental correspond à la mise en place d’un modèle d’infection pulmonaire dans lequel le pathogène est introduit dans les voies aériennes par inhalation réalisée sous anesthésie légère (moins de 5 min). Cette première procédure nécessitera 3 lots soit 72 souris. Le deuxième modèle sera un modèle de colonisation intestinale dans lequel les animaux (3 lots soit 72 souris) recevront une unique dose de pathogène par voie orale. Dans chaque modèle, un lot de souris recevra en plus un inhibiteur de l’inflammasome (3 injections tous les 2 jours). Des collectes de fécès quotidienne seront réalisés sur les animaux inclus dans le modèle de colonisation intestinale. Aucun prélevement sur animaux vigiles ne seront réalisés sur les animaux inclus dans le modèle d’infection pulmonaire. Les animaux seront mis à mort au bout des 5 jours de procédure.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Des effets indésirables pourraient etre observés avec les animaux infectés par le pathogène en intra-nasale (modèle d’infection pulmonaire). Ils pourraient montrer des signes respiratoires tels qu’un sifflement pulmonaire, des écoulements nasales ou une insuffisance respiratoire accompagnés de fièvre.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux des procédures 1 et 2 seront mis à mort afin d’effectuer des prélements d’organes (poumons, intestins, foie, rate), du sang et du liquide broncho-alvéolaire et permettre des analyses immunologiques afin d’étudier le rôle du pathogènes sur la réponse inflammatoire intestinale et pulmonaire et plus précisement sur l’inflammasome. Des analyses microbiologiques seront également effectuées par le dénombrement du pathogène dans les différents organes prélevés ainsi que dans le sang afin de voir l’impact de l’inflammasome sur les processus de colonisation, translocation et dissémination de la bactérie.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Notre approche expérimentale a inclus une première analyse in vitro avec des cellules eucaryotes en culture, mais elle reste largement insuffisante pour analyser l’implication de l’inflammasome dans la réponse inflammatoire induite par K. pneumoniae, car elle n’englobe que très partiellement la complexité de l’in vivo. Le modèle murin utilisé permettra de reproduire fidèlement dans un organisme complexe ce qui est observé en clinique lors de d’infections pulmonaires à K. pneumoniae et permettra ainsi de mieux caractériser le rôle de l’inflammasome (au niveau pulmonaire ou par l’intermédiaire de l’axe intestin-poumons) dans le développement des processus hyperinflammatoires lors des infections à K. pneumoniae.
2. Réduction
Les expérimentations seront organisées de façon à obtenir des résultats statistiquement exploitables avec le plus petit nombre d’animaux possible, et chaque expérience sera exploitée au maximum (prélèvement d’un maximum d’organes, prélèvement de sang, réalisation de lavages broncho-alvéolaires…). Le nombre minimal d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats significatifs est calculé à partir d’analyses statistiques. Nous utiliserons des lots de 8 souris ; ceci est classiquement utilisé afin de prendre en considération la variabilité/reproductibilité intra-lot. La variabilité inter-lot (entre les différentes conditions) ne peut pas être évaluée. Nous estimons que 3 répétitions par point de mesure pour chaque condition de culture (3 lots de 8 souris) sera suffisant pour prendre en compte la répétabilité inter-lot, et seront suffisantes pour obtenir une puissance statistique recevable. Nos précédentes études nous ont permis de confirmer que l’étude de groupes de 8 animaux permettait d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Des antalgiques seront administrés aux animaux pour réduire la douleur si nécessaire. Si cette douleur devait persister, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance.
3. Raffinement
Des échelles cliniques journalières et l’application de critères d’arrêts permettent de veiller au bien-être des animaux. Une grille de score et l’utilisation de points limites adaptés à chaque modèle permettra repérer les signes de stress et de douleur des animaux. Si des signes de douleur sont observés, l’animal concerné sera isolé dans une cage individuelle et des analgésiques lui sera administré. Les animaux présentant une perte de poids supérieure à 20% par rapport à leur poids en début d’expérimentation ou présentant des effets indésirables durant les procédures seront mis à mort immédiatement.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Les animaux utilisés seront des souris C57BL/6. Des publications internationales montrent que cette lignée est parfaitement adaptée pour étudier la virulence de K.pneumoniae au niveau pulmonaire et intestinal; le fond génétique C57BL/6 est préférable pour l’étude de l’immunité et des outils moléculaires sont disponibles pour cette espèce. Les animaux seront âgés de 6 semaines, âge où les souris ont un système immunitaire mature et fonctionnel caractérisé par un développement maximal des organes lymphoïdes secondaires et une réponse lymphocytaire complète (présence des différentes populations lymphocytaires matures).