Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 27/04/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-635202)
768 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Isolées en cage individuelle pendant quinze jours, elles reçoivent par gavage un microbiote intestinal humain, puis sont soumises à un modèle d’anorexie par restriction alimentaire ou à un modèle de boulimie, pour tester le lien entre microbiote et troubles du comportement alimentaire. Le porteur indique que la restriction peut provoquer fatigue, prostration et forte perte de poids, une chute de plus de 20 % sur trois jours déclenchant la mise à mort. Il affirme que le recours aux modèles animaux est « indispensable », faute d’un autre modèle étudiant ces aspects « dans leur globalité ».
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Les Troubles du Comportement Alimentaire (TCA) constituent des pathologies graves de l’adolescence et des jeunes adultes, avec un impact fort en termes de morbidité et de mortalité à long terme. Les TCA regroupent différentes formes : l’anorexie mentale, la boulimie et l’hyperphagie boulimique. La prévalence mondiale de ces maladies atteint 8,4% chez les femmes et 2,2% chez les hommes, ce qui en fait un enjeu de santé publique très important. Les mécanismes moléculaires à l’origine des TCA sont encore mal compris. Ce sont des maladies complexes et impliquant différents facteurs biologiques, psychologiques et socio-culturels. Le microbiote intestinal, qui correspond à l’ensemble des micro-organismes vivant à l’intérieur de l’intestin, pourrait être un de ces facteurs. En effet, ces micro-organismes interagissent et communiquent de façon très étroite avec l’intestin mais également avec le cerveau. Ce microbiote intestinal joue également un rôle dans la digestion, dans la régulation de la prise de poids et dans le comportement alimentaire. Il a été montré que la composition du microbiote intestinal de patients souffrant de TCA était modifiée par rapport à des individus sains. Ces changements pourraient avoir un impact sur la physiologie intestinale, notamment en favorisant l’apparition de troubles fonctionnels digestifs (une comorbidité fréquemment retrouvée chez les patients avec TCA). Notre projet de recherche propose donc d’étudier le rôle du microbiote intestinal dans l’apparition et la persistance de ces maladies et de certaines de leurs comorbidités. Notre projet de recherche reposera sur l’utilisation d’approches expérimentales de type « greffes de microbiote intestinal », de l’Homme vers la Souris, ainsi que sur l’utilisation de plusieurs modèles animaux reproduisant différents aspects des TCA étudiés : un modèle de boulimie et d’hyperphagie chez la souris C57Bl/6 (modèle murin « Binge Eating Disorder » ou BED) et un modèle d’Anorexie chez la Souris C57Bl/6 (modèle murin « Activity-Based Anorexia » ou ABA). L’ensemble des connaissances apportées par ces expériences permettra de mieux comprendre les mécanismes d’apparition et de persistance des troubles du comportement alimentaire. Nous espérons en particulier identifier de nouvelles approches thérapeutiques basées sur la manipulation du microbiote intestinal, qui viendront compléter les approches psychologiques et nutritionnelles actuellement utilisées pour lutter contre ces maladies.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
L’ensemble des approches expérimentales présentées dans ce projet nous permettront de déterminer s’il existe un lien de cause à effet direct entre les altérations du microbiote intestinal et l’apparition de troubles du comportement alimentaire. Les résultats obtenus permettront d’améliorer notre connaissance de la physiopathologie des Troubles du Comportement Alimentaire et ouvriront de nouveaux axes de recherche sur le développement de thérapies innovantes contre ces maladies, basées sur la modulation du microbiote des patients.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
– Tous les animaux de ce projet (768 souris) seront séparés en cages individuelles après une semaine d’acclimatation à l’animalerie. – Tous les animaux de ce projet (768 souris) seront pesés quotidiennement (animaux vigiles), soit 16 pesées pour chaque animal. Pour cela, les animaux seront extraits de leurs cages et pesés sur une balance adaptée. – L’ensemble des animaux de la procédure 2 (448 souris) et de la procédure 3 (224 souris) seront gavés oralement à 3 reprises (1 fois pour la première greffe de microbiote à J0, 1 fois pour la deuxième greffe de microbiote à J1 et 1 dernière fois à J16). Pour cela, les animaux (vigiles) seront extraits de leurs cages et maintenus en contention pendant quelques secondes. – Tous les animaux de ce projet (768 souris) seront extraits de leurs cages le dernier jour du protocole et maintenus en contention pendant 2 minutes (animaux vigiles) pour effectuer l’analyse de leur composition corporelle. – Tous les animaux de ce projet (768 souris) seront extraits de leurs cages le jour de la mise à mort et maintenus en contention pendant quelques secondes pour la réalisation d’une injection intrapéritonéale d’anesthésiques.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
– L’ensemble des expérimentations prévues nécessitent d’héberger les animaux pendant plusieurs jours en cages individuelles (15 jours). Cet isolement est indispensable pour pouvoir suivre la prise alimentaire et hydrique de chaque souris et évaluer leur activité physique. – La réalisation de greffes de microbiote intestinal par gavage oral chez la Souris nécessite de prendre les animaux en contention, ce qui peut engendrer un stress de quelques secondes. La mesure de composition corporelle (par Echo-MRI) nécessite également une contention d’une durée deux minutes. Ces différentes contentions seront réalisées par des expérimentateurs expérimentés afin de réduire au maximum le stress des animaux. – Le modèle murin d’anorexie « Activity-Based Anorexia » est un modèle très utilisé et bien documenté dans la littérature (Schalla et al., Front Nutr, 2019 ; doi: 10.3389/fnut.2019.00069). Suite à la restriction alimentaire imposée, les animaux peuvent présenter une fatigue, une prostration et une perte de poids importante. Tous ces paramètres sont pris en compte dans l’évaluation du bien-être animal. Le poids corporel sera suivi quotidiennement et fera également l’objet d’un point limite. – Le modèle murin de boulimie/hyperphagie boulimique « Binge Eating Disorder » est également bien documenté. L’accès intermittent à une nourriture riche en sucre et riche en graisse peut induire un stress lié au développement d’un comportement de type addictif. Cet aspect sera également pris en compte dans l’évaluation du bien-être animal.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
A la fin du protocole, l’ensemble des animaux seront mis à mort afin de pouvoir évaluer différents paramètres physiologiques et marqueurs biologiques et collecter un maximum d’information à partir de ces séries expérimentales.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Ce projet est un projet de recherche en physiologie intégrée visant à étudier les interactions entre les bactéries du microbiote, l’intestin et le cerveau. Ce projet se concentre notamment sur l’analyse de l’impact du microbiote sur la physiologie intestinale (particulièrement les troubles fonctionnels digestifs) et sur le comportement alimentaire. L’utilisation de modèles animaux est donc indispensable pour réaliser cette étude et atteindre les objectifs de ce projet car aucun autre modèle « non animal » actuel ne nous permet d’étudier ces aspects dans leur globalité.
2. Réduction
Pour nos expérimentations, le nombre d’animaux prévu est dimensionné par rapport au nombre de patients et volontaires sains qui seront inclus dans le protocole clinique (validé par le CPP Ile-de-France V). Nous avons limité ce nombre d’animaux de façon à garder une puissance statistique suffisante dans le traitement des résultats et de pouvoir conclure sur le rôle du microbiote dans l’apparition des troubles fonctionnels digestifs. Les différents paramètres physiologiques et comportementaux mesurés pour chaque lot d’animaux seront comparés. Les analyses de composition du microbiote feront l’objet d’un traitement statistique particulier adapté à ce type de données.
3. Raffinement
La mise en place d’un suivi strict de points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur des animaux au cours des expérimentations. L’ensemble des expériences sera mené par des personnels expérimentés, dans des locaux d’hébergement respectant les standards en vigueur. Pour limiter le stress des animaux, plusieurs points seront mis en place : – Après leur arrivée dans l’animalerie, les souris resteront pendant une semaine en période d’acclimatation avant le début des expérimentations. – Le milieu de la cage sera enrichi de coton pour permettre aux animaux de réaliser des nids. – Les animaux seront observés quotidiennement pour s’assurer de leur bien-être. Deux points limites seront évalués : – Au cours du modèle ABA (modèle de dénutrition), une attention particulière sera portée à la perte de poids. Un suivi quotidien sera réalisé et permettra d’évaluer le pourcentage de perte de poids des différents animaux. Une perte de poids supérieure à 20% du poids initial sur 3 jours consécutifs entrainera la mise à mort de l’animal. – Une évaluation de la souffrance animale sera réalisée à l’aide de l’échelle « Mouse Grimace Scale » composée de 5 items faciaux. Lorsque la somme des scores de ce critère sera supérieure à 5, les animaux recevront une injection sous-cutanée d’analgésique. Si la douleur persiste plus de deux jours, les animaux seront mis à mort. Lorsque la somme des scores de chaque critère sera supérieure à 7, les animaux seront mis à mort. – Au cours du modèle murin de boulimie/hyperphagie boulimique « Binge Eating Disorder », une attention particulière sera portée au développement d’un comportement de type addictif ou de sevrage chez les animaux lié à l’accès intermittent à la diète riche en sucre et riche en graisse Ces différentes manifestations seront prises en compte lors de nos observations quotidiennes des animaux et lors des tests comportementaux réalisés au cours de notre protocole.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La lignée C57Bl/6 a été utilisée par notre laboratoire pour la mise en place des techniques de greffe de microbiote intestinal et de déplétion du microbiote endogène des animaux greffés par antibiotiques (Tirelle et al., BMC Microbiol, 2020, DOI: 10.1186/s12866-020-02018-9). Cette lignée C57Bl/6 a d’autre part été utilisée à de nombreuses reprises par notre laboratoire pour l’étude du modèle ABA (Jésus et al., Clin Nutr, 2014, DOI : 10.1016/j.clnu.2013.11.006 ; Breton et al., Clin Nutr, 2021, DOI : 10.1016/j.clnu.2020.05.002). Il est donc pertinent de développer le modèle BED et d’effectuer l’ensemble des greffes de microbiote intestinal dans cette même lignée. Les souris seront livrées à l’animalerie à l’âge de huit semaines et utilisées pour les expérimentations à l’âge de neuf semaines (après 1 semaine d’acclimatation). Cet âge correspond un stade de jeune adulte chez les souris, ce qui correspond au pic d’incidence retrouvé chez l’Homme pour les troubles du comportement alimentaire (Galmiche et al., Am J Clin Nutr 2019 ; DOI : 10.1093/ajcn/nqy342).