Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 06/06/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-465245)
1280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des nouveau-nés reçoivent des cellules souches humaines pour reconstituer un système immunitaire humain, puis les souris subissent des greffes de peau avec deux greffons suturés en environ 90 minutes, des greffes d’îlots pancréatiques, l’induction d’un diabète par injection d’alloxan et une imagerie intravitale répétée. Le porteur indique que ces greffes peuvent provoquer des douleurs postopératoires et une perte de poids. Il affirme que l’efficacité de la thérapie cellulaire ne peut être évaluée qu’in vivo et présente les bénéfices pour les patients au conditionnel et à terme.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Aujourd’hui, la greffe d’organe est souvent le dernier recours pour les patients dont les organes vitaux sont défaillants. La greffe permet de retrouver une qualité de vie et d’améliorer la survie des patients. Néanmoins, les traitements anti-rejet ont de nombreux effets secondaires (infections et cancers). Le but de ce projet de recherche, prévu sur une période de 5 ans, est de développer une thérapie cellulaire et génique pour supprimer le besoin en anti-rejets. Il s’agit de modifier génétiquement les cellules régulatrices du système immunitaire du receveur pour qu’elles neutralisent la réaction de rejet. L’efficacité in vitro et in vivo de ces cellules régulatrices modifiées a été établie. Il est désormais indispensable de démontrer et d’optimiser leur efficacité dans des modèles précliniques de greffe pour mieux garantir un effet protecteur à long terme, une étape nécessaire pour son utilisation future chez l’homme. Seul un modèle murin de transplantation est capable de récapituler la complexité des phénomènes de rejet. Quatre types de modèles murins seront utilisés pour tester et optimiser l’utilisation d’immunothérapies dont les CAR-Tregs : 1- un modèle de greffe de peau chez des souris 12 semaines après la reconstitution de leur système immunitaire par des cellules souches humaines (souris humanisées) 2- un modèle de greffe de peau chez des souris 12 semaines après la reconstitution partielle du système immunitaire par des cellules mature humaines (souris semi-humanisées) 3- un modèle de greffe d’ilots chez des souris 12 semaines après la reconstitution de leur système immunitaire par des cellules humaines (souris humanisées) et 4-un modèle de maintien de la tolérance immune avec deux greffes de peau successives chez la souris humanisée. Au total, deux lignées immunodéprimées seront utilisées.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
A terme, ces expériences permettront : – de démontrer la synergie d’une immunothérapie ciblant les cellules dirigées contre les greffons et de CAR-Tregs – de montrer la possibilité d’expandre les CAR- Tregs in vivo, – et d’établir l’efficacité des CAR-Tregs à prévenir le rejet aigü et chronique de greffe de peau et d’ilots dans des modèles précliniques de souris humanisées. Cette nouvelle stratégie thérapeutique ambitionne d’améliorer la prévention des rejets en transplantation d’organe, tout en s’affranchissant de la toxicité des drogues immunosuppressives administrées au long cours. La prévention des réactions de rejet dans ces trois modèles complémentaires serait un argument préclinique très robuste et convaincant pour porter cette nouvelle stratégie vers une utilisation clinique.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Injection des cellules souches: Des nouveaux nés recevront des cellules souches humaines par voie intrahépatique sans anesthésie. Ce geste est réalisé une fois et dure quelques secondes. Injection et prélèvement sanguin: réalisés dans le sinus rétro-orbitaire en alternance sur chacun des yeux sous une courte anesthésie gazeuse
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les greffes de peau et d’îlots peuvent induire chez les animaux des douleurs les jours suivant la chirurgie accompagnée d’une perte de poids (>10%) et une perturbation de la mobilité par le bandage. L’injection d’alloxan risque d’induire une hypoglycémie transitoire avec une augmentation du taux d’insuline plasmatique due à la destruction du pancréas.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
A l’issus de chaque procédure, les animaux seront mis à mort pour le prélèvement d’organes.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Des études fonctionnelles in vitro ont été réalisées avec des cellules humaines afin d’optimiser la préparation de la thérapie cellulaire. Toutes les étapes visant à améliorer l’efficacité de la modification génétique des cellules régulatrices ont été mises au point in vitro. Toutefois, les expériences in vitro ne permettent pas d’évaluer la biodisponibilité, des CAR Trégulateurs dans les différents organes, ou leur capacité à migrer dans les greffons, et à induire une tolérance. En effet, lorsque les cellules sont greffées, elles se transforment en réponse à leur environnement, en particulier l’environnement inflammatoire induit pas la réaction de rejet, ce qui peut complètement modifier leur persistance et leur activité tolérogène. L’efficacité des approches de thérapie cellulaires ne peut être évaluée in fine que in vivo dans un modèle mimant la maladie humaine. Les expériences sur l’animal sont donc justifiées avant leur application chez l’homme.
2. Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux, les scores d’évaluation clinique les plus objectifs, prédictifs et robustes seront privilégiés. Le suivi par imagerie intravitale permet un suivi longitudinal des animaux et donc une réduction de leur nombre. Le nombre total de souris impliquées dans les expériences a été réduit au minimum nécessaire pour obtenir des données suffisantes tout en s’assurant d’une interprétation statistique fiable des résultats pour évaluer l’effet thérapeutique des produits testés. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d’animaux contrôles. Les résultats seront partagés avec la communauté scientifique pour éviter les doublons.
3. Raffinement
Afin de limiter la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, une surveillance rapprochée et l’utilisation d’antalgiques (buprénorphine) sont prévues. Une grille de score permettant d’évaluer objectivement les éventuelles souffrances, douleurs et détresses a été établie pour définir des points limites permettant d’anticiper l’administration d’analgésiques ou la mise à mort de l’animal si nécessaire. Une anesthésie gazeuse sera pratiquée pour chaque geste invasif (injection iv, prélèvement sanguin, chirurgie). Pour toute anesthésie prolongée, les animaux seront placés sur une plaque thermostatée permettant de maintenir leur température corporelle et du gel oculaire sera appliqué. La contention nécessaire pour l’imagerie in vivo sera accompagnée d’une anesthésie sous forme gazeuse par isoflurane. Dans le cas de l’anesthésie gazeuse, la vigilance de l’animal sera surveillée par pincement de la palme plantaire, mobilité des vibrisses et suivi du mouvement thoracique respiratoire et ce, jusqu’au réveil complet de l’animal. Pour réduire le stress éventuel engendré par la procédure, les animaux seront hébergés dans un environnement exempt d’organisme pathogène, enrichi à l’aide de coton (pour la nidification), de tunnels de polycarbonate (pour les activités journalières) et de bâtons en bois (pour développer leurs exigences naturelles comme ronger, grimper et se cacher). Les souris seront élevées en communauté. Cependant si cela n’est pas possible (agressivité entre deux souris par exemple), d’autres outils seront disponibles à la demande pour éviter l’ennui si des animaux se retrouvant seuls dans les cages. Pour réduire le nombre de manipulations et limiter le stress des animaux, l’imagerie in vivo sera faite en même temps la mesure du score.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris est le modèle le plus utilisé car sa génétique est proche de celle de l’homme et elle permet d’avoir des nombres d’animaux suffisants pour faire des tests statistiques. De plus, la souris est un modèle permettant d’effectuer des modifications génétiques relativement facilement. Ces modifications nous permettent d’avoir des modèles immunodéficients nécessaires pour la création de lignée dites humanisées, qui se rapprochent du système immunitaire humain. Pour la constitution des souris humanisé par injection de cellules souche humaines, les animaux seront âgés de 1 à 3 jours car c’est une période durant laquelle la greffe de cellule humaine est la plus efficace. Concernant les greffes de peau/ilots, elles seront réalisées 14 semaines post injection des cellules humaines pour permettre une reconstitution complète du système immunitaire humain. Pour le modèle de greffe d’ilots sur souris partiellement humanisées, les animaux seront greffés à l’âge de 8 à 12 semaines.