Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 06/06/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-659950)
2920 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tuées pour prélèvement d’organes et une vingtaine réutilisées dans un autre projet. Chaque souris reçoit sous anesthésie deux injections intradermiques dans les oreilles, un anticorps IgE puis l’antigène, provoquant une inflammation de l’oreille, suivies d’administrations de candidats médicaments et de prélèvements sanguins répétés. Le porteur décrit ce modèle d’anaphylaxie cutanée passive comme un outil de « screening » de molécules pour les maladies auto-immunes et indique n’avoir pas relevé de signe de douleur au-delà de l’inflammation locale. Il affirme qu’un modèle substitutif in vitro n’a pas abouti et revendique le recours à l' »organisme » complet de la souris.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’objectif de cette demande d’autorisation est de mettre en place un modèle d’anaphylaxie passive cutanée (PCA : Passive Cutaneous Anaphylaxis) permettant d’étudier rapidement l’impact de candidats médicament sur la dégranulation des cellules mastocytes in vivo, mécanisme impliqué dans certaines maladies auto immunes. Pour cela un anticorps au format IgE dirigé contre un antigène du non soi est injecté sous anesthésie générale dans le pavillon de l’oreille en intradermique pour sensibiliser la souris, puis quelques heures plus tard l’antigène (et un colorant physiologique et indolore pour la souris permettant de suivre la perméabilité vasculaire) est injecté provoquant dans les minutes qui suivent un gonflement de l’oreille et une coloration bleue de l’oreille (deux paramètres que nous suivrons) due à une activation des cellules mastocytes qui vont relarguer de nombreux granules comme l’histamine notamment. L’évaluation de candidats médicaments dans ce type de modèle vise à évaluer si le traitement par ces candidats permet de diminuer l’anaphylaxie (réaction allergique survenant rapidement après contact avec l’agent inducteur) observée au niveau cutané, mécanisme impliqué dans certaines maladies auto-immunes. Dans le processus de développement d’un candidat médicament, ce type d’étude se situe en aval des études in vitro et in silico. Il permet de sélectionner les candidats sur la base de leur capacité à diminuer l’activité du système immunitaire dans le domaine des maladies auto-immunes et également d’étudier la biodisponibilité de ces candidats (distribution de la molécule dans le corps durant les traitements). Les études incluses dans ce projet prévoient des évaluations cliniques et biologiques (prélèvements sanguins pour notamment doser la présence des anticorps en cours d’étude et prélèvements d’organes terminaux pour valider l’expression des cibles thérapeutiques). Ces prélèvements sont adaptés en termes de volume/fréquence conformément aux standards éthiques et réalisés avec les méthodes les moins contraignantes possibles (ex : prélèvement de petit volume sanguin à la veine saphène)
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Les bénéfices attendus sont de pouvoir évaluer l’impact de nos candidats médicaments sur la dégranulation des mastocytes dans un modèle préclinique en amont de toute étude clinique.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Selon la phase de développement du modèle et la procédure expérimentale associée mise en oeuvre : -chaque souris reçoit deux injections intradermiques (une dans chaque oreille) réalisées sous anesthésie générale (moins d’une minute) ; +/- 23h plus tard et selon la phase de la mise au point : administration du véhicule, composé de référence ou candidat médicament en per os, Intra veineuse, sous cutanée ou intra péritonéale sur souris vigile (moins de 30 secondes) ; suivi 1 heure plus tard d’une injection en intraveineuse en vigile (moins de 30 secondes) ; photographies de la coloration de l’oreille et mesures de l’épaisseur de l’oreille par pied à coulisse sur souris vigile (au maximum 4 mesures – moins d’une minute à chaque mesure) ; Durée totale des études de 48h heures maximum.Tout au long de l’étude chaque souris pourra se voir prélever un petit volume de sang par µsampling (prélèvement de petit volume sanguin à la veine saphène – moins de 30 secondes).
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Inflammation locale de l’oreille de la souris durant de la durée de l’étude (1 heure à 24 heures) -Administration de composés candidats médicaments selon les voies classiques intra-péritonéale intra-veineuse sous-cutanée ou per os
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les souris incluses dans la première phase de mise au point de ce modèle ne nécessitant pas de prélèvements de tissus pourront être réutilisées dans le cadre d’un autre projet. A l’issue de chaque procédure, les animaux seront sinon euthanasiés pour collecte des organes et tissus et analyses in vitro des échantillons (immohistochimie, etc).
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
La recherche de nouveaux médicaments dans la prise en charge des maladies auto-immunes repose sur une première phase d’identification de candidats médicaments efficaces sur leur cible au moyen de modélisations in silico et in vitro. L’efficacité thérapeutique d’un candidat médicament ne peut être démontrée qu’après administration chez l’animal, dans le contexte d’un organisme complet et complexe incluant l’ensemble des mécanismes physiopathologiques. Les pathologies auto-immunes sont par essence multifactorielles et impliquent un grand nombre de types cellulaires et de médiateurs, qu’il n’est donc pas possible de modéliser complètement in vitro. Seules les molécules les plus abouties et les plus avancées dans leur développement sont administrées in vivo. Dans le cadre plus spécifique de ce projet, les tentatives de mise en place d’un modèle substitutif à ce modèle in vivo n’ont pour l’instant pas abouti et nous ne disposons pas d’un modèle de dégranulation in vitro suffisamment fiable et permettant le même niveau de prédictibilité que celui mené dans l’organisme de la souris avec toute sa complexité et l’intégralité des différents composants du système immunitaire.
2. Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera affiné au fur et à mesure de la mise en place de ce modèle. Les conditions expérimentales des premières étapes sont directement basées sur les données de la littérature pour ce modèle très communément réalisé. Un accompagnement par le service Biostatistique sera assuré afin d’affiner les designs expérimentaux, d’estimer la variabilité des paramètres et in fine le nombre d’animaux nécessaire par groupe pour les procédures 2 et 3 à l’aide d’un t test. De plus pour les premières phases chaque animal sera son propre contrôle, une seule des deux oreilles recevant l’agent inducteur et la seconde étant le contrôle.
3. Raffinement
L’administration de l’antigène par voie systémique va entrainer une inflammation locale du pavillon de l’oreille ayant reçu l’anticorps au forma IgE de cet antigène. Dans le cadre de cette DAP les doses utilisées du couple Anticorps/Antigène sont basées sur une analyse bibliographique et pour lesquels il n’a pas été relevé de souffrance ou de signes de douleur (si ce n’est l’inflammation locale de l’oreille qui est le paramètre étudié dans ce modèle) Des prélèvements de sang répétés en cinétique sont réalisés à différents temps afin de mesurer les paramètres biologiques d’intérêt et/ou le taux plasmatique du médicament. Les prélèvements de sang sont effectués selon la technique du « multisampling » à la veine latérale de la patte, méthode systématiquement privilégiée par rapport aux autres techniques usuelles car rapide, réalisable plusieurs fois sur un même individu, et respectant les volémies et les conditions physiologiques de la souris. Cette technique permet également de réduire considérablement le nombre d’animaux inclus par étude Les administrations intradermiques dans chaque oreille sont réalisées sous anesthésie générale. Un suivi quotidien des animaux sera réalisé par les expérimentateurs et le personnel assurant leur soin. Ce suivi permettra d’identifier tout signe de souffrance et d’appliquer les mesures nécessaires au soulagement des souris en cas d’atteinte de points limites prédéfinis. Les souris seront hébergées en groupes sociaux et disposeront de matériel de nidification dans leur cage d’hébergement.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris présente certains traits caractéristiques similaires à l’Homme dans la biologie des réactions immuno-inflammatoires rendant ainsi pertinente son utilisation. De nombreux modèles ont montré un fort parallélisme dans les différents médiateurs mis en jeu lors des maladies auto-immunes (auto-anticorps, cellules du système immunitaire, cytokines, …). Par ailleurs l’utilisation de candidat médicament comme les anticorps nécessitent souvent l’utilisation de modèles murins dits humanisés, dans lesquels le gène cible a été remplacé par manipulation génétique par le gène cible humain sans incidence sur le phénotype. La protéine humaine exprimée pourra alors être détectée par le ou les anticorps candidats Idéalement, les souris sont utilisées à l’âge adulte, à partir de 8-9semaines, soit un poids corporel d’environ 18-20g. C’est l’âge classiquement utilisé dans tous les protocoles qui seront réalisés dans la sélection des candidats médicaments.