Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 31/07/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-377894)
123 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal reçoit une injection sous-cutanée de Mycobacterium ulcerans dans la queue, la bactérie de l’ulcère de Buruli, avant le prélèvement de son tissu cutané après sa mise à mort à 45 jours. Le porteur indique que ce protocole n’est pas de la recherche mais l’entretien de la virulence de souches bactériennes, les souris étant utilisées pour régénérer des bactéries que la culture artificielle rend incapables de produire leur toxine. Il qualifie ce recours d' »indispensable » et décrit l’infection comme indolore, en s’appuyant sur trente ans de pratique.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’ulcère de Buruli ou infection à Mycobacterium ulcerans est la troisième mycobactériose dans le monde. Cette maladie handicapante causée par M. ulcerans sévit principalement dans les zones tropicales humides de l’Afrique de l’ouest et centrale. Pour lutter contre cette maladie aux conséquences socio-économiques dramatiques, il est nécessaire de développer des approches prenant en compte les spécificités de cette maladie. Elles exigent le développement de projets globaux intégrant différentes facettes de la biologie du bacille. M. ulcerans sécrète une toxine appelée mycolactone. La mycolactone est une toxine lipidique qui est indispensable à la bactérie pour coloniser ses hôtes vertébrés ou invertébrés. Elle présente divers effets biologiques dont les principaux sont l’immunomodulation et l’analgésie. Dans ce contexte, nos projets s’articulent autour de trois axes : – Etudes de la régulation de la synthèse de la mycolactone dans des modèles in vitro puis in vivo – Identification des stratégies déployées par le bacille pour coloniser ses hôtes à l’échelle cellulaire et d’organismes entiers. – Etudes des effets analgésiques de la mycolactone. Ainsi, il nous est donc indispensable d’utiliser des souches produisant la mycolactone. Le génome de M. ulcerans possède plus de 260 séquences d’insertions, qui en raison de leur mobilité rendent les souches incapables de produire la mycolactone après 2-3 passages (repiquages) sur des milieux de culture artificiels, et donc les souches « perdent » leur virulence. A ce jour, malgré nos efforts (recherche de milieux sélectifs…), l’unique moyen de conserver la capacité des bactéries à produire la mycolactone est de réaliser des passages successifs chez l’animal (souris). Depuis trente ans nos souches sont entretenues par ce moyen. Sans recours à l’animal, nous ne pourrions plus développer nos projets de recherche, tout particulièrement ceux utilisant des approches in vitro (limitant l’utilisation d’animaux) ou requérant de la mycolactone purifiée. Ainsi notre présente demande n’est pas d’un projet de recherche sensu stricto mais d’un protocole requérant l’utilisation d’animaux pour obtenir des souches bactériennes « virulentes » qui seront utilisées pour nos différents projets de recherche tout particulièrement pour développer des approches in vitro permettant de limiter l’utilisation d’animaux.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Le bénéfice de ce protocole n’est pas direct puisqu’il ne s’agit pas d’un projet de recherche. Mais il est indispensable à l’ensemble de nos projets de recherche visant à (i) étudier l’effet analgésique de la mycolactone (nouvel analgésique) (ii) comprendre la physiopathologie de l’infection à M. ulcerans incluant les systèmes de régulation de la synthèse de la mycolactone.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Pour ce protocole, la nuisance prévue est l’inoculation en sous cutanée de 50 µL d’une suspension contenant M. ulcerans. Pour limiter cette nuisance l’injection se fera sous anesthésie gazeuse. La colonisation des tissus cutanés (uniquement autour du site d’injection) induit une inflammation non douloureuse puisque M. ulcerans produit une toxine aux propriétés analgésiques puissantes (rendant les lésions indolores). Aucun prélèvement ne sera réalisé sur animal vigile. Les prélèvements des tissus cutanés seront effectués 45 jours post inoculation sur des animaux morts. Les animaux subiront une unique injection sous cutanée, (seringue 1mL, aiguille 26G) lors de l’inoculation bactérienne sous anesthésie générale (isoflurane). La durée de l’injection en sous-cutanée dans la queue dura moins de 20 secondes.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les effets indésirables sont liés à l’injection. L’injection peut produire une douleur légère. Pour atténuer cette douleur, l’injection en sous cutanée se sera sous anesthésie gazeuse. Le risque majeur est lors de l’inoculation de M. ulcerans, où une surinfection peut survenir dans les jours qui suivent. Selon notre expérience (sur 30 ans) les cas de surinfection sont rares ( 2°C à la normale, l’animal sera euthanasié. Si la température est normale mais que le comportement de l’animal ne redevient pas à la normale dans les 48h, l’animal sera mis à mort. Il est à noter que la mycolactone produite lors de l’infection présente un effet analgésique rendant les lésions indolores. Ainsi, nous n’avons jamais observé de gêne chez les animaux infectés par M. ulcerans (perte de poids, changement de comportement).
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Le but de ce protocole est de prélever le tissu cutané de la queue infectée par M. ulcerans. Dans ce contexte tous les animaux seront euthanasiés.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Le bien-être animal a été une des priorités dans la conception de cette étude mais nous ne pouvons à ce stade nous passer d’utiliser des animaux. L’utilisation de ces animaux permet de fournir du matériel à l’ensemble des projets de l’équipe permettant ainsi de réaliser de nombreuses expériences/criblage in vitro limitant ainsi l’utilisation d’animaux.
2. Réduction
Le nombre d’animaux prévu pour ce protocole est suffisant pour satisfaire l’ensemble des projets de recherche qui en dépendent. Il s’agit là d’un entretien de souche. Ce protocole ne requière pas d’utilisation d’analyses statistiques.
3. Raffinement
Afin de raffiner les conditions de vie des souris, un suivi adapté des animaux a été instauré afin de réduire, supprimer ou soulager l’inconfort, mais aussi la détresse ou l’angoisse qu’elles pourraient éprouver. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux et bénéficient d’un enrichissement adapté. Un suivi régulier sera effectué sur l’ensemble des animaux et des indicateurs comportementaux et physiques sont prédéfinis et constituent les points limites. Pour éviter toute souffrance ou stress lors de l’inoculation dans la queue, un anesthésique volatil (isoflurane) sera utilisé et le geste réalisé par une unique personne qui pratique régulièrement cette procédure (le porteur de projet). Il est important de souligner que la colonisation du tissu cutané par M. ulcerans est indolore. En effet, le bacille produit une toxine qui présente des propriétés analgésiques rendant le site infectieux hypo-esthésique. Les animaux subiront une surveillance accrue les 15 premiers jours post inoculation pour surveiller le risque de surinfection lié à l’inoculation (rarement observé ;
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
L’espèce souris est un très bon modèle pour étudier l’infection à M. ulcerans puisque cette espèce est « très sensible à l’infection ». Nos études antérieures ont montré que l’injection de moins de 10 bacilles était suffisante pour permettre une colonisation. De plus, le développement de l’infection est très homogène. Les souris utilisées peuvent être indifféremment des Balb/c ou des Swiss. Nous utiliserons donc souris des Balb/c ou des Swiss en fonction des disponibilités dans les élevages. Les animaux utilisés pour ce protocole devront être âgés de 8 semaines (maturation immunitaire) minimum.