Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 01/08/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-361052)
588 animaux non-humains, 307 souris et 281 rats, vont être utilisés, tous tués à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La plupart reçoivent une injection d’oligonucléotides antisens dans le liquide céphalo-rachidien ou le cerveau, suivie de séances d’imagerie TEP ou ultrasonore sous anesthésie et, pour certains, d’une chirurgie d’amincissement du crâne. Le porteur mentionne des tests comportementaux chez soixante rats sans en préciser la nature, et signale des risques de paralysie, d’œdème et d’ataxie. Il justifie l’usage de deux espèces par le besoin de disposer de données chez le rat comme chez la souris pour de futurs candidats-médicaments.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Il existe aujourd’hui plus de 5 000 maladies neurologiques rares qui touchent près de 350 millions de personnes dans le monde. 70% d’entre elles se manifestent pendant l’enfance et la majorité ne dispose d’aucun traitement. La plupart de ces maladies orphelines présentant une origine génétique, il est envisageable d’utiliser des traitements ciblant la cause génétique de ces maladies. Les oligonucléotides antisens (ASOs), qui sont capables d’interagir spécifiquement avec l’ARN messager, ont montré des résultats prometteurs pour certaines de ces maladies, mais atteignent très difficilement le système nerveux central. La voie intrathécale (consistant à injecter ces agents directement dans le liquide céphalo-rachidien) a montré de meilleurs résultats, mais cette voie reste encore méconnue. Il est nécessaire de réaliser des études dédiées afin de mieux comprendre comment obtenir une diffusion dans le cerveau et un effet thérapeutique optimal des ASOs après injection intrathécale. Afin de répondre à cette problématique, nous souhaitons développer et évaluer chez le rat et la souris des techniques d’imagerie qui permettront de mesurer la distribution et l’effet d’ASOs dans le cerveau par voie intrathécale. La mise en place de tels outils est cruciale pour guider le développement préclinique et clinique de futurs candidats-médicaments ciblant l’ARN dans les maladies neurologiques. Nous évaluerons la possibilité de marquer directement des ASOs à l’aide d’isotopes radioactifs ou de groupements chimiques fluorescents, permettant leur visualisation directe, respectivement en imagerie par tomographie par émission de positons (TEP) ou par microscopie. Nous utiliserons également des approches d’imagerie indirectes qui permettront d’étudier l’intensité et la durée des effets spécifiques des ASOs sur des cibles et mécanismes moléculaires.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Les besoins thérapeutiques liés aux maladies du système nerveux central ne sont que partiellement couverts par les médicaments actuels, en particulier les maladies orphelines génétiques. Les oligonucléotides antisens ont le potentiel de traiter efficacement ces maladies mais leurs propriétés pharmacocinétiques et pharmacodynamiques ne sont pas suffisamment connues, en particulier par voie intrathécale. Cette étude sera donc très importante à la fois pour le développement préclinique (et à plus long terme, clinique) des ASOs en apportant des informations inédites.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
La quasi-totalité des animaux (237 rats sur 281 et 249 sur 307 souris) recevra une injection intrathécale (au niveau des lombaires, entre les méninges dites de l’arachnoïde et de la dure-mère, afin d’atteindre le liquide céphalo-rachidien), sous anesthésie et analgésie locale (10 minutes). Les autres animaux (44 rats et 58 souris) recevront une injection intracérébrale, également sous anesthésie et analgésie générale et locale (1h). Ensuite, les animaux pourront : – soit n’être exposés à aucune autre nuisance à part une anesthésie terminale nécessaire au prélèvement du cerveau (total de 179 rats et 115 souris), – soit être utilisés pour une ou plusieurs sessions d’imagerie de TEP sous anesthésie d’une durée d’une heure (total de 72 rats, dont 60 recevront également des tests comportementaux pendant 70 minutes le lendemain de chaque imagerie, et 36 souris) ou de 2 à 6 heures (30 rats et 30 souris) – soit être utilisés pour une ou plusieurs sessions d’imagerie ultrasonore sous anesthésie (1h), la première session étant précédée la veille par une chirurgie d’amincissement du crâne (30 min) sous anesthésie et analgésie (96 souris) – soit être utilisés pour plusieurs sessions d’imagerie fUS éveillée (30 min) puis imagerie TEP sous anesthésie (20 min), avec une première chirurgie (30 min) sous anesthésie et analgésie de pose d’un chapeau nécessaire à l’imagerie éveillée (quelques jours avant la première session), suivie d’une période d’habituation progressive aux sessions d’imagerie en tête-fixée sur une à deux semaines (sessions d’habituation de 5 minutes les premiers jours à 1 heure le dernier jour), puis d’une seconde chirurgie d’amincissement du crâne (30 min) sous anesthésie et analgésie la veille de la première session (30 souris).
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
La procédure d’injection par voie intrathécale peut s’accompagner d’effets indésirables tels une paralysie ou une fuite de liquide céphalo-rachidien entraînant un œdème. Certains ASOs sont susceptibles d’entraîner des symptômes d’anxiété, ou des troubles moteurs de type ataxie, voire une perte de poids.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux à la fin de la procédure seront mis-à-mort afin de permettre diverses analyses histologiques ou moléculaires du tissu cérébral.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’objectif de l’étude est de mieux comprendre la biodisponibilité et l’effet d’oligonucléotides antisens administrés par la voie intrathécale, et ne peut donc pas être atteint avec des modèles in vitro. La voie intrathécale étant assez invasive et peu d’ASOs étant à ce jour validés pour une utilisation clinique, il est nécessaire de réaliser cette étude chez l’animal.
2. Réduction
Selon notre expérience en termes de variabilité et de taille d’effet sur ces données d’imagerie, le nombre d’animaux par groupe pour les techniques d’imagerie in vivo a été estimé à 8 sur la base d’un calcul de puissance statistique. Nous prévoyons 2 animaux supplémentaires par groupe en prenant en compte la possibilité d’échec de l’injection dans le liquide céphalo-rachidien (le taux de succès de l’injection étant rapporté autour de 80% dans la littérature). Pour les groupes de validation préliminaire des ASOs par stéréotaxie ou les approches ex vivo telles que l’autoradiographie ou la microscopie, les groupes de 3 à 6 animaux seront constitués étant donné les besoins statistiques plus limités pour ces analyses et la meilleure résolution spatiale de ces techniques. Concrètement, les données expérimentales générées seront traitées à l’aide de tests de Student ou d’analyse de variance à deux dimensions (two-way ANOVAs), selon les paramètres évalués, ou de tests non paramétriques équivalents, en fonction de la distribution normale ou non de nos données. Dès lors que la question expérimentale le permet, les mêmes animaux seront étudiés pour plusieurs sessions d’imagerie, permettant une réduction du nombre d’animaux.
3. Raffinement
Les injections seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie locale. Les animaux seront surveillés régulièrement grâce à une grille de score et des points limites adaptés prenant en compte les éventuels troubles liés à l’injection intrathécale, voire aux troubles liés à la baisse d’expression des protéines étudiées dans les procédures 2 et 3. En cas de signes de détresse, la procédure serait interrompue et la mise à mort de l’animal serait effectuée. L’environnement sera enrichi avec morceaux de bois, boites ou cylindres et nourriture en pâtée après la chirurgie.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le rat et la souris sont deux espèces utilisées très régulièrement dans le développement préclinique de médicaments en général, et pour modéliser des pathologies du système nerveux central. Nous souhaitons donc obtenir des informations pertinentes chez les deux espèces qui seront utiles par la suite lors de l’évaluation de candidats-médicaments ASOs dans des modèles rongeurs d’intérêt, qui pourront être le rat ou la souris en fonction des pathologies. Adulte, afin d’étudier les mécanismes de biodistribution des ASOs sur des cerveaux pleinement développés.