Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 19/09/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-285780)
183 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une chirurgie de ligature et ponction du cæcum leur provoque un choc septique, avec mobilité fortement réduite, absence de réaction aux stimuli et baisse de la prise alimentaire, pour tester une molécule stimulant l’O-GlcNAcylation comme piste thérapeutique. Le porteur décrit un modèle dont la mortalité propre avoisine 30 % et intègre cette perte au calcul des effectifs, en transposant à la souris des résultats déjà obtenus chez le rat. Les retombées cliniques annoncées restent renvoyées au long terme, l’objectif immédiat étant de valider l’innocuité et la dose du composé.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Le choc septique (défaillance multi-viscérale survenant au cours d’une infection grave associée à un syndrome de réponse inflammatoire systémique ou SIRS) est un problème de santé publique majeur dont l’incidence augmente avec le vieillissement de la population et dont la mortalité est comprise entre 30 et 50%. Malheureusement il n’existe pas de traitement adapté au choc septique ou au SIRS, conduisant à la mort de plus de 45 000 personnes par an en France. Il devient donc urgent de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Le SIRS caractérise par une libération, une expression anormalement élevée d’une multitude de composés de l’inflammation. La manifestation du SIRS chez l’adulte inclut au moins 2 des critères suivants : une altération de la respiration, une dérégulation de la température, une tachycardie et un état hyper ou hypo-inflammatoire. De façon générale, un patient est considéré en état de SIRS lorsqu’il présente deux critères ou plus. Nous avons développé en collaboration avec une équipe américaine une approche visant à stimuler l’O-GlcNAcylation dans le choc septique. L’O-GlcNAcylation est une modification post traductionnelle responsable de la survie cellulaire qui joue un rôle majeur dans la réponse au stress. Les approches développées par nos deux équipes visent à augmenter de manière très précoce les niveaux de O-GlcNAc, et sont associées à une réduction importante des marqueurs de stress, à une amélioration de la fonction cardiovasculaire et une forte réduction de la mortalité dans le choc septique. Nous démontrons que la stimulation de l’O- GlcNAcylation présente un potentiel thérapeutique important pour la survie des patients. Le but du projet est de 1) valider l’innocuité des molécules chez un modèle murin, 2) valider une cinétique et une dose d’administration et enfin 3) confirmer les résultats obtenus chez le rat chez une autre espèce.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Avec les différents résultats précédemment obtenus par l’équipe dans un modèle de ligature et ponction caecale chez le rat, les résultats attendus sont une amélioration de la réponse inflammatoire, une amélioration de la fonction cardiovasculaire et des différents marqueurs de stress des animaux traités et ceux à différents temps d’administration. Ces résultats seront objectivés par une étude in vivo de la fonction et du stress cardiovasculaire (pression artérielle, fréquence cardiaque), rénale (créatinine) et hépatique mais également par des tests biochimiques (RT-qPCR et Western Blot) validant l’effet de la molécule testée. Lors de cette étude, les paramètres précédemment cités seront comparés entre les différents groupes (Contrôle, malades, malades + traitement). Les retombées à plus long terme peuvent être majeures avec la mise en place d’une nouvelle stratégie thérapeutique en clinique.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
L’ensemble des animaux sera soumis à 4 interventions. La première intervention consiste en la chirurgie afin de développer le choc septique (uniquement la chirurgie pour le groupe contrôle). Cette intervention dure environ 20 à 30 minutes (sur la base des expériences précédemment menées sur le rat). La deuxième intervention consiste à une injection de buprénorphine 6h après la chirurgie (à 14h le jour de la chirurgie) sur un animal vigile. Cette intervention dure quelques secondes. La troisième intervention consiste à une injection de buprénorphine 12h après la chirurgie (à 20h le jour de la chirurgie) sur un animal vigile. Cette intervention dure quelques secondes. Enfin la quatrième et dernière intervention consiste à une chirurgie afin d’avoir accès aux valeurs hémodynamiques des animaux. L’intervention dure environ 5 à 10 minutes (sur la base des expériences précédemment menées sur le rat).
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Le modèle de ligature et ponction caecale est un modèle représentant la symptomatologie du choc et de fait un modèle sévère. Au cours de ce protocole, l’état de santé des animaux va s’aggraver du fait du développement du choc septique avec une mobilité fortement réduite, une absence de réaction aux stimuli sonores et toucher mais également une diminution de la prise alimentaire, sans toutefois de réel impact sur le poids, le protocole n’ayant une durée que de 24h. Enfin, une douleur peut être associée à la chirurgie réalisée sur l’animal (laparotomie). L’apparition de ces effets indésirables est environ 2 à 3h après l’induction du choc et jusqu’au sacrifice.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
A la fin de la procédure 1 (procédure sévère), tous les animaux ne présentant pas de signes de souffrance trop important seront gardés en vie pour la procédure 2. Seuls les animaux démontrant des signes de souffrances trop importants seront euthanasiés en fin de procédure 1. A la fin de la procédure 2 (procédure sans réveil), tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d’organes.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Le choc septique est une pathologie complexe faisant intervenir de nombreux mécanismes complexes et intégrés, nécessitant impérativement l’utilisation de modèles animaux. L’usage des animaux est justifié uniquement car ce modèle n’est pas remplaçable.
2. Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit de façon à obtenir des données statistiques suffisamment puissantes (dans la mesure du possible, les tests seront réalisés en aveugle afin d’augmenter la puissance de l’étude). Les animaux seront utilisés à un âge adulte. La taille des animaux permet de réaliser plusieurs analyses sur un même animal et donc de limiter le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux pour les groupes en choc septique est calculé de la façon suivante : un nombre d’animaux statistiquement viable est sélectionné (n=15). A cela s’ajoute la mortalité associée au modèle (environ 30%) mais également l’exclusion de certains animaux (entre 20% et 40% avec les résultats précédemment obtenus) soit entre 15/0.7*0.8 = 26,7 soit 27 animaux et 15/0,7*0,6= 35,7 soit 36 animaux. Les tests statistiques utilisés seront des tests Kruskall-Wallis avec post test de Dunn’s non corrigé.
3. Raffinement
Les différentes procédures expérimentales de la première étape (mise au point) seront réalisées sur des effectifs réduits afin de déterminer les conditions (i) de transposition du modèle du rat à la souris et (ii) d’utilisation optimales. Dans un second temps, lorsque la transposition à la souris et les conditions d’utilisation optimales auront été déterminées, les procédures seront réalisées sur un plus grand nombre d’animaux avec seulement les conditions sélectionnées dans la première étape. Afin de raffiner le modèle, des mesures seront mises en place afin de maximiser le confort des animaux par exemple avec la mise en place de scores et de points limites comprenant des critères morphologiques (aspect, comportement) et physiologiques (température, fréquence respiratoire), l’administration d‘un antidouleur en début de procédure et toutes les 6 heures post-chirurgie est prévue et la réinjection d’une dose supplémentaire peut être considérée en cas de signe de douleur. De plus, nous associerons une infiltration d’un anesthésiant local (lidocaïne 0,5%, maximum de 0,03mL) au niveau de la zone incisée. Tout au long de l’étude, les animaux seront hébergés par 3 dans des cages avec enrichissement, sur portoirs ventilés et avec accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Un respect strict des cycles jour/nuit sera observé. Après chirurgie, afin d’éviter au maximum le stress, les animaux seront replacés avec leurs congénères opérés le même jour. Tout au long des procédures, les animaux seront sous une couverture anesthésique (mélange O2/sévoflurane – induction : 8% à 1L/min ; maintien : 3% à 0,5L/min). Nous proscrirons l’usage d’anti-inflammatoires non stéroïdiens du fait de leur impact sur l’inflammation, voit majeure dans la physiopathologie du choc septique. La liste des points limites est présentée en annexe. Ces points seront adaptés avec la phase de mise au point. Un score sera établi et des décisions seront prises en fonction de ce score afin de limiter la douleur de l’animal. Si nous observons que notre score n’est pas totalement adapté lors des premières expériences, nous modulerons la rigidité de ce dernier toujours dans le but de réduire au maximum la souffrance animale. Les gestes réalisés au cours de ce projet sont des gestes simples et maîtrisés par l’équipe chez le rat (cathétérisation artérielle, ligatures du caecum).
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Ce modèle est, historiquement et actuellement, l’un des plus utilisé et des mieux décrit. Sa proximité avec la symptomatologie du choc septique chez l’Homme, sa facilité de mise en place en fait un modèle efficace pour cribler et valider l’efficacité des traitements. Les souris utilisées sont des souris C57BL/6J de 10-12 semaines, âge standard pour ces manipulations. La taille des animaux permet de réaliser plusieurs analyses sur un même animal et donc de limiter le nombre d’animaux utilisés. 10-12 semaines. C’est un âge standard pour ce genre de manipulations. De plus la taille des animaux permet de réaliser plusieurs analyses sur un même animal et donc de limiter le nombre d’animaux utilisés.