Revitalisation de lignées de souris à partir de sperme et d’embryons congelés

Les lignées de souris transgéniques sont maintenues soit sous forme de colonies vivantes au sein de notre animalerie ou dans les animaleries de collaborateurs scientifiques. La préservation de ces lignées est essentielle pour la poursuite des projets de recherche ayant motivé leur création. Les lignées sont conservées par croisement avec de jeunes parents (environ 4 mois) car de nombreuses lignées de souris peuvent présenter des troubles de la fertilité en vieillissant. Pour éviter cela, nous devons générer des nouveaux individus très souvent. Cela représente de nombreuses souris qui sont conservées sans être utilisées dans nos projets scientifiques. Notre objectif est de réduire le nombre de ces animaux et de ne générer que les animaux indispensables à nos travaux de recherche. Pour cela, nous utilisons la cryo-préservation. Aussi, chacune de nos lignées est stockée sous forme d’embryons congelés ou de sperme congelé dans des cryo-préservateurs au sein de notre institut et certaines d’entre elles sont déposées dans un centre de ressource public. Quand nous aurons besoin d’utiliser l’une de ces lignées, nous la raviverons. Selon les mutations étudiées, les lignées seront régénérées par fécondation in vitro à partir de sperme décongelé préalablement en utilisant des ovocytes venant de femelles superovulées. La superovulation permet de réduire le nombre de femelles donneuses d’ovocytes et d’embryons après fécondation. Pour des lignées de génotype complexe des embryons sous forme de morulas (embryons formés de 16 cellules) ont été congelés et ces embryons seront décongelés. Puis les embryons seront transplantés chez des femelles receveuses. Les souriceaux issus de ces transplantations permettront de régénérer les lignées nécessaires à nos projets scientifiques. Notre objectif final est de réduire le nombre de nos souris dans notre animalerie.

Afin d’éviter une production continuelle de souris, dans le but de mieux répondre à la règle des 3 R et pour des raisons économiques également, nous avons appris à cryo-preserver le sperme de nos lignées que nous n’utilisons pas durant une période pouvant s’étendre de quelques mois à quelques années. Cela nous permet d’avoir uniquement les animaux vivants nécessaires à nos projets scientifiques dans l’animalerie, les autres modèles étant conservés sous forme d’embryons congelés ou sous forme de sperme congelé dans des cryo-préservateurs au sein de notre institut et certaines d’entre elles sont déposées dans un centre de ressource public. Dans le cas où les lignées sont régénérées par fécondation in vitro, la superovulation de femelles donneuses permet de réduire le nombre de souris utilisé car les cycles ovulatoires sont synchronisés. En absence de traitement hormonal, nous obtenons en moyenne 8 oocytes par femelle. En appliquant ce protocole, le nombre d’ovocytes ovulés en moyenne est de 20 ovocytes (2.5 fois plus que normalement). En résumé, notre projet permettra de réduire fortement le nombre de souris utilisées à un temps donné, tout en assurant la préservation de nos lignées.

Les lignées seront régénérées par fécondation in vitro à partir de sperme décongelé préalablement et réimplantation des embryons au stade 2 cellules ou par transfert d‘embryons au stade morula. 50 femelles donneuses d’ovocytes achetées chez un fournisseur agréé seront superovulées par injection intrapéritonéale afin d’obtenir un nombre maximum d’ovocytes par femelle. Les ovocytes seront fécondés in vitro par le sperme décongelé afin d’obtenir des embryons au stade 2 cellules, qui ont commencé à se développer. La transplantation des embryons ou morulas sera réalisée par intervention chirurgicale non dommageable. Cela concerne 295 femelles.

Pour la procédure 1 de superovulation, aucune aggravation résultant directement du traitement n’est attendue. Aucun critère d’arrêt anticipé spécifique de la procédure n’est prévu. Les animaux sont néanmoins individuellement manipulés à l’occasion de chaque injection, de la mise en accouplement et de la détection des bouchons vaginaux suivant l’accouplement. Des animaux éventuellement trouvés prostrés, blessés à l’issue d’accident ou bagarre seront sacrifiés immédiatement par dislocation cervicale. Pour la procédure 2 de réimplantation d’embryons in utero, un suivi post opératoire individuel des animaux inclus dans la procédure chirurgicale sera matérialisé par le renseignement d’une fiche de suivi. Il n’est pas attendu d’effets dommageables durables du transfert par voie chirurgicale. Des effets dommageables à court terme et/ou accidentels peuvent résulter de la laparotomie abdominale. Les contrôles prévus prendront place pendant l’intervention chirurgicale, au réveil de l’animal le même jour, le lendemain de l’intervention et le jour suivant. Brièvement, des difficultés opératoires (hémorragies, temps d’intervention trop long) ou post opératoire majeures (réveil retardé, saignements, suintements ou ouverture de la plaie, altérations de l’état général : posture de l’animal, mobilité spontanée, entretien du pelage) conduiront systématiquement à l’euthanasie de l’animal concerné.

Les femelles donneuses et receveuses seront euthanasiées en fin de procédure, pour donner des ovocytes (donneuses) et assurées une gestation (receveuses). Les femelles receveuses ne seront pas réutilisées pour prévenir une deuxième opération qui pourrait être plus difficile et douloureuse que la première opération.

Nous avons choisi la souris (Mus musculus) comme le modèle de choix, en raison de ces similarités génétiques et physiologiques proches de l’homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. Nous avons tous les outils à notre disposition et déjà au point pour pouvoir étudier ces modèles d’ablation/gain-de-fonction conditionnelle inductible dans la souris. De surcroît, toute la collection des systèmes Cre nécessaires à l’inactivation/gain de fonction génétique conditionnelle n’existe que chez la souris. Nous utiliserons des femelles adultes âgées d’environ 8 semaines car c’est la période de fécondité optimum.