Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 22/09/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-021605)
135 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sous la peau du dos des hydrogels nutritifs porteurs de cellules souches humaines, avec des séances d’imagerie répétées et, pour une partie, une thoracotomie avec injection d’un agent radio-opaque, pour évaluer la survie de ces cellules en vue de réparer l’os. Le porteur signale des douleurs, des risques d’infection et une gêne liée à la taille des implants. Il conclut qu’aucune méthode in vitro ne reproduit l’environnement complexe suivant l’implantation et qu’un « modèle in vivo » est nécessaire.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Les greffes osseuses autologues (autogreffes) sont largement utilisées en clinique pour des interventions de reconstructions osseuses mais présentent plusieurs limites. L’ingénierie tissulaire osseuse se développe comme une alternative à la greffe osseuse en associant des biomatériaux à des cellules souches, principalement des cellules stromales mésenchymateuses (CSMs) capables de se différencier en ostéoblastes (cellules de l’os) et de promouvoir la revascularisation du site afin de régénérer le tissu osseux. Malgré des résultats encourageants et la preuve de la sécurité de l’utilisation des CSMs chez l’Homme, l’efficacité de ces matériaux cellularisés dans la réparation osseuse reste inférieure à celle de l’autogreffe. La forte mortalité des cellules implantées (90%) observée lors des deux premières semaines post-implantation est un des facteurs clés expliquant ces résultats suboptimaux. Cette mortalité serait due aux conditions ischémiques (manque d’oxygène et de nutriments) rencontrées après implantation. Comme nous avons démontré que les CSMs survivaient in vitro et in vivo à l’absence d’oxygène mais pas à celle de nutriments, nous avons développé, en collaboration avec une autre équipe, un hydrogel nutritif à base de fibrine (couramment utilisée en clinique) capable de libérer du glucose après implantation par digestion d’un polymère de glucose par une enzyme, tous deux contenus dans l’hydrogel. Des expérimentations in vitro ont déjà démontré que ces hydrogels amélioraient significativement la survie et la fonctionnalité des CSMs en conditions ischémiques. Les premiers résultats in vivo ont également été encourageants mais suboptimaux et nous avons donc amélioré la composition de nos hydrogels afin de prolonger la libération du glucose. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer in vivo l’effet bénéfique de ces hydrogels nutritifs optimisés sur la viabilité et la fonctionnalité (potentiels à induire des vaisseaux sanguins et de l’os) des CSMs.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
L’objectif ultime du projet est de développer une alternative à la greffe osseuse pour combler des grandes pertes osseuses chez l’Homme. L’os est en effet le deuxième tissu le plus transplanté après le sang, avec plus de 2,2 millions de greffes osseuses réalisées chaque année dans le monde. Les transplants osseux sont généralement récoltés chez le patient (autogreffes), mais les complications associées au site donneur, ainsi que la faible quantité et/ou qualité de l’os récolté chez les patients âgés, pédiatriques ou cancéreux constituent des limites sérieuses pour cette technique. Les produits d’ingénierie tissulaire osseuse représentent donc un traitement alternatif aux autogreffes prometteur. Toutefois, plusieurs études ont montré que les cellules implantées ne survivent pas assez longtemps pour induire une formation osseuse suffisante pour combler des défauts osseux de grande taille. Le développement d’un hydrogel nutritif améliorant la survie et la fonctionnalité des cellules implantées permettrait donc d’améliorer le potentiel réparateur de ces produits d’ingénierie tissulaire osseuse.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Pour tous les animaux (135 souris) : Les animaux vigiles auront une injection sous-cutanée d’analgésique 30 min avant l’injection intra-péritonéale d’anesthésiant. Lorsque l’anesthésie générale est bien établie deux à quatre incisions cutanées seront effectuées dans le dos et les hydrogel mis en place (1x, durée 20-30 min). Les incisions seront suturées. Dans les 24h suivant l’opération, les animaux vigiles auront deux injections sous-cutanées d’analgésique à 12h d’intervalle. Pour les animaux de l’étude 1 (30 souris) : ils subiront une anesthésie générale gazeuse avant injection sous-cutanée d’un réactif bioluminescent puis 40 min après seront à nouveau anesthésiés au gaz pour l’acquisition du signal bioluminescent. La procédure sera répétée 6 fois pendant la période d’implantation (6x, durée 5+5min, sur 4 semaines). Au temps terminal de l’étude les animaux seront anesthésiés au gaz et auront une injection intrapéritonéale d’une surdose d’anesthésiant (1x, durée 10 min). Pour les animaux de l’étude 2 (90 souris) : les animaux vigiles auront une injection sous-cutanée d’analgésique 30 min avant l’injection intra-péritonéale d’anesthésiant. Lorsque l’anesthésie générale profonde est bien établie, les animaux auront une thoracotomie suivie d’une infiltration du réseau vasculaire par un agent radio-opaque (1X, durée 30 min). Pour les animaux de l’étude 3 (15 souris) : au temps terminal de l’étude les animaux seront anesthésiés au gaz et auront une injection intrapéritonéale d’une surdose d’anesthésiant (1x, durée 10 min).
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
La chirurgie d’implantation en sous-cutané (135 souris) peut entraîner de la douleur et du stress chez l’animal. La douleur sera néanmoins prise en charge par un traitement analgésique approprié. La perte d’un ou plusieurs points de suture en post-opératoire peut-être également observé occasionnellement, mais sans impact sur le bien-être animal. Une autre complication éventuelle est l’infection cutanée (bien que jamais observée dans notre laboratoire). Enfin, la taille des implants pour 90 souris peut entraîner une gêne de l’animal mais qui disparait dans les 48h post-implantatoire. Les anesthésies gazeuses nécessaires à l’imagerie non invasive en bioluminescence (30 souris) vont entrainer du stress au moment de la contention et de la perte de conscience, mais n’entrainent aucune séquelle après le réveil. Enfin, les animaux subiront également plusieurs injections sous-cutanées pour la gestion de la douleur, l’anesthésie et l’imagerie en bioluminescence. Celles-ci suivront les bonnes pratiques vétérinaires.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les animaux seront mis à mort aux temps terminaux de chaque étude afin de permettre l’explantation des hydrogels et des analyses post-mortem (radiologiques, histologiques et/ou analyses de l’expression génique).
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’environnement ischémique post-implantatoire est un environnement complexe dont de nombreux facteurs (pH, oxygène, osmolarité, etc.) peuvent affecter la survie et la fonctionnalité des cellules implantées. Bien que certains de ces facteurs soient bien caractérisés (oxygène) d’autres n’ont pas ou peu étaient explorés (glucose, pH, etc.). Il n’est donc pas possible à ce jour de reproduire cet environnement post-implantatoire dans des modèles in silico ou in vitro. De plus, de nombreuses interactions cellulaires (avec les cellules vasculaires ou les cellules de l’inflammation, par exemple) et moléculaires (par l’effet d’hormones ou de facteurs de croissance) peuvent également affecter le devenir des cellules implantées. Bien que des modèles in vitro (organoide, co-culture) permettent de reproduire certaines des interactions cellules-cellules, ils n’incluent que 2 ou 3 interactions (cellules souches/macrophages, par exemple) et ne capturent pas toute la complexité moléculaire et cellulaire de l’environnement post-implantatoire. Pour toutes ces raisons les alternatives non animales actuellement disponibles ne sont pas appropriées pour étudier la survie des CSMs en vue d’une réparation osseuse et il est nécessaire d’avoir recours à un modèle in vivo.
2. Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux l’étude 1 est une étude de suivi longitudinal, où les mêmes animaux seront imagés au cours du temps (et non un animal/temps). Basé sur les premiers résultats d’un précédent projet nous avons supprimé un temps d’analyse (semaine 1) pour l’étude du potentiel des CSMs à induire des vaisseaux sanguins, une procédure (imagerie rayon X) pour l’étude du potentiel des CSMs à former du tissu osseux, et un groupe contrôle pour ces deux études car les premiers résultats apportent peu de renseignement sur la capacité de nos hydrogels à promouvoir la fonctionnalité des CSM. En se basant sur les variations de résultats observées dans nos études in vivo précédentes en site sous-cutané, nous affecterons 10 implants/groupe afin d’avoir un pouvoir statistique suffisant. Pour les analyses statistiques, un test non paramétrique sera effectué pour une comparaison globale entre les groupes suivi d’une comparaison des groupes deux à deux.
3. Raffinement
Une période d’acclimatation et de désensibilisation de 7 jours sera accordée aux animaux avant leur entrée dans le protocole expérimental. La souffrance liée à l’implantation sous-cutanée sera limitée par analgésie pré- et post-opératoire toutes les 12 heures pendant 24h. Un gel nutritif sera ajouté lors des 3 premiers jours post-opératoires, pour faciliter la prise de nourriture et l’hydratation des animaux. Suite à la procédure chirurgicale, des points limites définis au préalable sur le comportement, l’aspect général et les signes cliniques spécifiques à l’acte chirurgical seront surveillés et scorés et permettront d’objectiver la douleur ou la gêne de l’animal deux fois par jour pendant les 3 premiers jours post-opératoires, puis deux fois par semaine jusqu’aux points terminaux. En cas de manifestations douloureuses et/ou d’inconfort l’analgésie sera augmentée ou prolongée. Si ces manifestations sont réfractaires aux soins adaptés et/ou si des points limites sont atteints, l’animal sera retiré de l’étude et euthanasié. Une analgésie pré-opératoire appropriée sera administrée aux animaux avant tout geste chirurgical.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le modèle animal choisi est la souris immunodéficiente non consanguine. Le modèle souris est le mieux connu en termes de caractérisation génétique et immunologique. De plus, la fine épaisseur de la peau murine atténuant peu le signal, ce modèle permet d’utiliser des appareils d’imagerie non-invasive, tel que la bioluminescence, pour un suivi longitudinal des implants. L’utilisation de souris immunodéficientes (souris Nude) permet d’éviter une réaction immunitaire averse (rejet) lors de greffes d’origine humaine et ainsi d’évaluer le potentiel de cellules d’origine humaine. Jeunes adultes de 10 semaines pour avoir des animaux entre 25 et 30g et dont la croissance et le développement, toujours en cours, permettent d’avoir un potentiel de néovascularisation et de néoformation osseuse optimal.