Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 16/10/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-984161)
1 424 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections dans le plexus veineux derrière l’œil, par la trachée, par gavage ou dans l’abdomen, et sont infectées par des bactéries pour provoquer un sepsis suivi d’une perte de poids et de poils hérissés. Le porteur indique retenir un inoculum faible censé éviter la mortalité, et précise qu’aucun anti-inflammatoire ne peut être administré sur un projet portant sur le système immunitaire. Il étudie le rôle de lymphocytes régulateurs dans l’immunodépression qui suit une infection sévère et affirme que seule l’étude in vivo permet cette approche globale.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Notre laboratoire a montré que suite d’une infection sévère, une cicatrice immunitaire se mettait en place, avec des perturbations prolongées des capacités des organismes à se défendre contre une nouvelle infection. Cette cicatrice immunitaire associé à un plus haut risque de complication infectiologique secondaire est associée à l’apparition de plusieurs populations de lymphocytes dont l’activation des lymphocytes dit « T régulateurs » spécialisés dans le contrôle de l’inflammation. Nous avons montré qu’une sous population ces lymphocytes T régulateurs porteur d’un récepteur de type 2 au Tumoral Necrosis Factor (aussi appelé TNFR2) jouaient un rôle majeur la survenue de cette immunodépression faisant suite à une infection sévère. Les objectifs du projet sont de caractériser le rôle de ces populations de lymphocytes T régulateurs porteur du récepteur TNFR2 au cours de la défense anti-infectieuse et lors de la phase d’immunodepression post-septique.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Notre projet nous permettra d’améliorer nos connaissances des mécanismes d’extinction des capacités de réaction du système immunitaire faisant suite à une infection sévère aussi appelée immunosuppression post-septique (IS). Ce projet nous aidera à comprendre les modifications induites par le sepsis sur les fonctions des lymphocytes des Treg et les conséquences de ces modifications au cours d’une 2ème infection. Ceci nous permettra la mise en place de traitements adaptés pour lutter contre les infections bactériennes.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Tous les animaux de ce projet sont soumis à une administration intra-veineuse retro-orbitale sous anesthésie générale. Un tiers des animaux de ce projet est soumis à une administration intra-trachéale sous anesthésie générale. Deux tiers des animaux sont soumis à une administration unique per os (sonde de gavage pour l’administration du traitement) en condition vigile. Un tiers des animaux est soumis à des injections intrapéritonéales en condition vigile. Tous les gestes sont de courte durée (au maximum 1 minute) et pour les souris anesthésiées, le réveil est quasiment instantané. En fonction de l’état général des souris (grille de score d’évaluation des points limites) et si nécessaire, une ou plusieurs injections sous-cutanées d’analgésiques pourraient être réalisées.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Modèles d’infection bactérienne : Le modèle d’infection par administration de bactéries par voie intra-veineuse, a déjà été validé dans ce projet, nous utiliserons des souches bactériennes de référence de laboratoire. Nous réaliserons une injection dans le plexus veineux sous orbitaire d’une suspension bactérienne. Suite à l’administration de bactéries (inoculum faible concentration) par voie intra-veineuse, une inflammation est attendue durant les 4 premiers jours avec comme signes cliniques une perte de poids inférieure à 20% et des poils hérissés, suivis d’une récupération progressive de leur poids au 5ième jour du sepsis. Cette injection entraine une septicémie sans induction de mortalité, permettant d’évaluer l’impact d’une seconde infection et d’éviter les biais de sélection. Les procédures de gavage et de transfert adoptif utilisées au cours des procédures expérimentales n’induisent pas d’effets indésirables connus chez la souris. La pesée de référence est réalisée au J0 avant le début de l’induction du sepsis ou de tout autre procédure. Avec l’utilisation d’un inoculum bactérien faible pour l’induction du sepsis (permettant de reproduire l’IS), aucun signe de souffrance n’est observé en dehors d’une perte de poids inférieure à 20% et les poils hérissés. L’effet de la délétion du TNFR2 sur les Treg sur le sepsis. Il est envisageable que les Treg étant moins suppresseurs, les effets du sepsis sur l’état général des souris pourraient être plus marqués. Il en est de même pour l’effet du traitement par des anticorps anti-TNFR2 sur le sepsis. Pour ces raisons, Les animaux seront observés quotidiennement pendant 3 jours après l’induction du sepsis et pesés tous les 48 à 72h de façon à s’assurer que s’il y des effets, ils ne soient pas durables dans le temps. Les modèles d’inflammation respiratoires aiguës sont des modèles avec une récupération de l’état général des souris à partir de J2. Suite à l’infection, une perte de poids transitoire (2-3jours) et modérée (inférieure à 10%) est observée, sans perte de motricité. Après J2, les souris reprennent une courbe de poids normale.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux utilisés dans cette étude seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélèvement d’organes et analyse des modifications immunologiques.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Les mécanismes responsables d’une immunosuppression suite au sepsis sont à l’heure actuellement mal compris. Les méthodes in vitro développées par d’autres laboratoires de recherche ne permettent pas une étude globale des modifications entrainées par une activation du système immunitaire. L’étude du rôle des Treg dans cette maladie et la mise au point de nouveaux traitements ne peut se faire qu’in vivo. Cependant, dès que la question scientifique le permet nous privilégions l’utilisation de méthodes substitutives (méthode in vitro et ex vivo) pour y répondre. Nous avons développé des protocoles de culture de Treg primaires permettant de disposer d’une grande quantité de Treg.
2. Réduction
Le nombre de souris a été réduit au minimum (n=7) afin de permettre une analyse statistique fiable des résultats. Le test statistique utilisé sera une Anova suivie d’un test post-hoc. Une valeur de p inférieure à 0,05 sera considérée comme significative.
3. Raffinement
L’état général des souris est évalué quotidiennement. Un tableau d’évaluation par scoring des points limites adapté aux modèles a été mis en place. En fonction des scores obtenus, une ou plusieurs injections de buprénorphine seront réalisées. L’utilisation d’anti-inflammatoire n’est pas possible dans le cas de projet sur le système immunitaire. Comme indiqué dans notre tableau de points limites, il est également prévu un apport d’enrichissement en cas de signes cliniques légers ou modérés, définis par les scores de 1à 14 suivant notre échelle de suivi (cf annexe). Afin de limiter la douleur consécutive à l’administration intratrachéale, la sonde de gavage de 24G est préalablement enduite d’anesthésiant local afin d’anesthésier localement la trachée. Une anesthésie générale est réalisée pour les procédures d’injection intraveineuse. Pour les injections IV en retro-orbital, en plus de l’anesthésie par inhalation, une anesthésie ophtalmique sera réalisée sur l’œil qui recevra l’injection. Les souris génétiquement modifiées utilisées dans ce projet ne présentent aucun phénotype dommageable, en comparaison des souris contrôles, elles ne développent aucune forme de maladie apparente même à l’âge d’un an.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Les modèles murins d’infections bactériennes sont des modèles fiables et reproductibles. Les résultats issus de ces modèles peuvent être transposés à l’homme avec une très bonne correspondance des résultats trouvés à la fois en médecine humaine et en expérimentation animale pour les datas déjà générées dans ce projet de recherche. 7-14 semaines de vie. A ce stade le système immunitaire est mature