Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 17/10/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-034690)
1 100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures classées en souffrance sévère. Elles sont infectées par la bactérie Pseudomonas par voie urétrale, nasale, abdominale, plantaire ou intraveineuse, puis reçoivent des inhibiteurs testés pour réduire la virulence, avec des prélèvements répétés de sang et d’urine. Le porteur reconnaît que ces infections peuvent provoquer une inflammation urinaire ou pulmonaire et un affaiblissement général qualifiés de sévères. Il vise de nouvelles cibles contre les infections nosocomiales et juge le recours à l’animal « irremplaçable » pour suivre la dissémination bactérienne entre organes.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Les bactéries du genre Pseudomonas y compris Pseudomonas aeruginosa, sont présentes dans le monde entier dans le sol et l’eau. Elles préfèrent les endroits humides, tels que les éviers, les toilettes, les piscines insuffisamment traitées par le chlore, les spas et les solutions antiseptiques périmées ou inactivées. Ce sont des pathogènes opportunistes qui touchent principalement les personnes présentant un système immunitaire affaibli. En effet elles représentent à elles seules plus de 8% des infections nosocomiales en France. Ces bactéries peuvent infecter le sang, la peau, les os, les oreilles, les yeux, les voies urinaires, les valves cardiaques et les poumons, ainsi que les plaies (telles que les brûlures, les blessures ou les plaies d’origine chirurgicale). L’utilisation de matériel médical tel que les cathéters qui sont insérés dans la vessie ou les veines, les tubes respiratoires et les systèmes de ventilation mécanique, augmente le risque d’infections à Pseudomonas aeruginosa. Cette bactérie représente un problème de santé publique majeur avec plus de 550 000 morts globalement chaque année et une résistance accrue aux antibiotiques. En 2017, l’Organisation mondiale de la santé OMS a classé Pseudomonas parmi les trois premiers micro-organismes « critiques » qui constituent une menace en raison de leur capacité à devenir de plus en plus résistants à tous les antibiotiques disponibles. La découverte de nouvelles molécules antibactériennes devient donc une nécessité face à un futur manque d’antibiotiques efficaces. Il est donc nécessaire de mieux comprendre la virulence de cette bactérie pour développer de nouvelles stratégie d’anti virulence contre ce pathogène bactérien. Le but de notre étude est d’étudier et de cibler les facteurs de virulences de Pseudomonas au cours d’infection chez la souris.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
L’étude des facteurs de virulence de Pseudomonas va permettre de mieux comprendre les mécanisme mis en place par la bactérie pour infecter l’hôte. Cela permettra d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques qui viserait à diminuer la virulence de ce pathogène et donc de diminuer les symptômes associés à des infections nosocomiales qui représentent 750 000 infections par an en France et qui sont en lien direct de 4 000 décès par an.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les souris vont recevoir une inoculation de bactéries par différentes voies suivant la procédure : trans urétral (2 injections à 1h ou 6h d’intervalle suivant le modèle) ; intra nasale (une injection) ; intra péritonéale (une injection) ; voie coussinet plantaire (une injection) ; intraveineuse (une injection). Dans chacunes des procédures nous allons tester des inhibiteurs de facteurs de virulence qui seront eux injectés via différentes voies suivant l’inhibiteur sélectionné : i) traitement par eau de boisson comme cela peut être réalisé avec les antibiotiques, traitement de 48 à 72h, ii) par injection IP sur 3 jours à 24h d’intervalle, iii) par gavage comme il est souvent utilisé pour les antibiotiques également, 3 gavages à 24h d’intervalle ou iv) par injection trans-urétrale (pour la procédure 1) 3 injections à 24h d’intervalle. Pour chaque lot de souris un prélèvement de sang à la queue sera effectué pour récupérer 20 µl qui permettrons de faire une énumération sanguine De plus un prélèvement d’urine quotidien (hors weekend) par contention de la souris et application d’une bandelette de buvard au niveau de l’urètre sera réalisé pour suivre la colonisation vésicale au cours du temps dans le modèles d’infection urinaire.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Certaines de ces procédures expérimentales pourront entrainer une souffrance chez l’animal avec des effets locaux (inflammation de l’appareil urinaire ou pulmonaire) ou encore systémiques (affaiblissement de l’état général par exemple). Ces nuissances seront qualifiées comme sévères.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
A la fin de toutes les procédures tous les animaux seront euthanasiés car nous avons besoin de récupérer différents tissus et liquide biologique pour réaliser une analyse ex vivo.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’utilisation de méthode alternative in vitro a été préalablement réalisée pour démontrer l’impact des différentes souches mutées ou non ou des inhibiteurs sur la cellule eucaryote en culture. Le recours à l’animal est cependant irremplaçable car aucun autre modèle ou tube à essai ne permet d’examiner la dissémination bactérienne entre les différents organes. De plus les objectifs sont i) de découvrir le(s) rôle(s) des différents facteurs de virulences sur la colonisation de Pseudomonas, ii) d’identifier des inhibiteurs de Pseudomonas qui permettront de diminuer sa virulence iii) de mesurer les effets des facteurs environnementaux sur leur expression in vivo. En effet suivant l’organe cible de Pseudomonas, l’environnement sera forcément très différent (exemple vessie vs poumons). Or on sait que les interactions entre la bactérie et son environnement vont être très importants et non négligeables dans notre étude, et cette interaction complexe ne peut être modélisée in vitro.
2. Réduction
Certains des modèles décrits précédemment sont déjà mis en place dans l’équipe, c’est le cas par exemple du modèle d’instillation dans la vessie, ou encore l’infection en coussinet plantaire. Les autres modèles vont devoir être mis en place au laboratoire, mais nous nous appuyons uniquement sur des modèles déjà établis dans la littérature. De plus nous utiliserons des inhibiteurs déjà testés in vitro et décrit dans la littérature ou utilisés chez l’homme dans d’autres contextes. Enfin les gestes à réaliser pour les modèles qui ne sont pas encore implantés au laboratoires sont déjà acquis par le personnel de l’équipe dans le cadre d’autres projets. Une attention particulière est portée sur le nombre d’animaux strictement nécessaire pour chaque expérience. Plusieurs paramètres seront analysés chez chaque animal (signes cliniques, charge bactérienne, prélèvements de tissus et fluides lors de la nécropsie) pour réduire le nombre d’animaux nécessaires. De plus une étude longitudinale sera réalisée à L’IVIS (In Vivo Imaging System) qui est un système d’imagerie tomographique sur animal vigile. Il permet de visualiser des marqueurs fluorescents ou bioluminescents, dans notre cas des bactéries, dans les différents organes de la souris (vessie, poumons, rate …) sur des animaux vivants endormis à l’isoflurane. Une bonne corrélation entre le signal de bioluminescence et le nombre de bactéries retrouvées dans les organes par analyse microbiologique a été établie dans des expériences précédentes. Cet outil nous permettra de suivre le niveau d’infection des souris de manière longitudinale sans les euthanasier, nous permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux.
3. Raffinement
Le bien-être de l’animal sera en permanence au centre de nos préoccupations. Les conditions d’expérimentations font l’objet d’une procédure de suivi du bien-être animal. Les animaux seront suivis quotidiennement et plus fréquemment pendant les phases aigues. Des points limites adaptés seront mise en oeuvre afin d’évitre toute souffrance inutile de l’animal.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris est le mammifère le plus facilement manipulable pour l’étude des facteurs de virulence de Pseudomonas dans des conditions in vivo. De plus la littérature sur les différents modèles proposés avec Pseudomonas est largement décrite. Souris de 5 à 9 semaines suivant le modèle expérimental. Dans la littérature, les souris utilisées pour les différents modèles décrits sont classiquement âgées entre 6 à 9 semaines. Nous prenons une marge d’une semaine pour respecter la période d’acclimatation.