Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 20/12/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-065496)
1 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections directement dans le cerveau sous anesthésie et des prélèvements de sang, avant d’être tuées pour prélever leurs organes, afin de valider des vecteurs censés faire passer des médicaments vers le système nerveux. Une lignée de souris est génétiquement humanisée pour le récepteur ciblé. Le porteur, une société, met en avant un « gain de temps considérable » et « donc économique », à côté de l’argument scientifique.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
-Introduction : Les maladies neurodégénératives (pathologies affectant les neurones), et maladies rares font partie des causes majeures de handicaps sévères dans le monde. A l’heure actuelle, les besoins médicaux restent malheureusement sans solutions, traitements curatifs, ou palliatifs (qualité de vie). Ainsi, ces neuropathies sont de très bons exemples d’enjeux de santé publiques. C’est dans ce contexte scientifique que notre société a développé un savoir-faire qui consiste à attacher des protéines ou peptides avec un fragment d’anticorps (aussi appelé VHH), l’ensemble couplé à un médicament afin de passer plus efficacement les barrières physiologies, notamment la Barrière Hémato-Encéphalique du cerveau (BHE). Ces molécules ou vecteurs, appelés VHH pourront ainsi atteindre le tissu cible du système nerveux central et traiter les cellules malades. Pour l’instant, la plupart des médicaments utilisés en thérapie restent inefficaces par manque de passage de ces barrières sélectives et donc d’accès aux tissus à traiter. Concept général : L’objectif principal de notre société sera donc de proposer de nouvelles formulations capables de reconnaître spécifiquement leurs partenaires naturellement exprimés (endogènes), au niveau des barrières cellulaires de l’organisme et d’utiliser leurs mécanismes naturels de passage pour ainsi, délivrer les médicaments au niveau central (cérébral). Par cette technique du cheval de Troie, nous faciliterons le passage de médicaments du sang vers le système nerveux central (SNC). -Objectif du projet : Les études pharmacologiques passent par différentes étapes de validation avant tout développement pré-clinique, elles utiliseront des voies d’administrations simplifiées pour qu’elles puissent être facilement applicables à grandes échelles et moins contraignantes pour les patients. Ces traitements sont généralement administrés par voie périphérique, sous-cutanée, intra-veineuse ou par voie orale. L’optimisation de nos vecteurs (VHH) devra avant tout développement périphérique passer par une étape de validation et confirmation de l’efficacité au niveau central. A travers cette demande de projet et la réalisation d’injections intra-cérébrales, nous tenterons d’améliorer l’action de nos molécules VHH-médicaments sur souris consanguines, dites « standards », puis, de le confirmer ces résultats sur ce même fond, humanisé pour le récepteur cible.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
-Validation de l’efficacité pharmacologique de nos molécules VHH pour améliorer les traitements actuels et apporter des solutions thérapeutiques contre les pathologies à enjeux de santé publique. Ce nouvel axe de recherche pré-clinique pourrait ainsi servir de levier dans le traitement des maladies du système nerveux, au même titre que les derniers vaccins innovants développés pour la lutte contre la COVID-19. -Choix d’une lignée de souris humanisée pour le récepteur ciblé : La transposition de nos recherches sur un modèle murin pour lequel nous avons humanisé le récepteur cible permet, non seulement d’appréhender les futurs développements pré-cliniques de nos vecteurs (VHH), mais aussi d’anticiper les possibles effets secondaires ou toxicités associées. Son utilisation assure de développer au maximum les études sur le modèle murin (souris) avant d’engager la phase préclinique et la transposition à l’homme, lesquelles auraient certainement nécessité des séries de tests supplémentaires sur divers modèles animaux de plus grandes tailles. De plus, cela constitue un excellent outil stratégique et scientifique, permettant in fine, une réduction importante du nombre d’animaux au sein des cohortes, sans parler du gain de temps considérable pour la société, et donc économique.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Au cours de cette procédure, nous allons avoir une étape d’anesthésie et analgésie pour réaliser les administrations centrales : -Analgésie : Anti-douleur administré 30 minutes avant le début de l’anesthésie (durée 1h) -Anesthésie générale : Anesthésie gazeuse (voie aérienne) par induction en chambre (5 minutes), puis relais au masque (durée 15-20 minutes maximum) pour réaliser les administrations. Puis, au cours de la cinétique, nous aurons trois étapes de prélèvements : -Un premier prélèvement de sang sur des temps intermédiaires en cours de cinétique (maximum X3 espacés de minimum 24h). Réalisés sur animal éveillé et immobilisé dans une contention spécialisée (durée 2 minutes), par une micro incision de l’extrémité de la queue. Cette étape très rapide et peu invasive se fait sans trop de contraintes, ni stress pour l’animal. Le saignement est ensuite stoppé par un point de pression à l’aide d’un papier absorbant stérile pour une cicatrisation rapide. -Un deuxième avec le prélèvement sanguin en point final en toute fin de cinétique (durée 3 minutes), en post-mortem. -La troisième étape consiste à récupérer les organes et tissus d’intérêts, toujours en post-mortem (durée 5 à 10 minutes en fonctions de la quantité de tissus à prélever pour les tests post-expérimentaux) .
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Dans ce projet nous chercherons à limiter au maximum le stress induit aux animaux. Les possibles sources de stress, angoisse et/ou douleurs sont ici listées avec une description des principaux actes engagés afin d’éviter leurs apparitions qui seront détaillés ci-après dans la partie procédure correspondante. -Transport et adaptation : Arrivée des animaux et stabulation qui peuvent engendrer du stress et un impact sur l’alimentation et le comportement -Tonte avant chirurgie et constitution des groupes : manipulation qui pourrait générer une source de stress -Chirurgie et injection (infusion lente) : Pas de risques notables avec une bonne maîtrise des antalgiques et anesthésiques. -La pose de points et période de cicatrisation : Pas de risques par une bonne réalisation de points individuels. -Effets secondaires toxiques et immunogènes des composés en suivi post-administration : Pas de risques majeurs pour les animaux (et études) car ces paramètres sont anticipés. -Nettoyage et traitement des plaies à la vétédine savon : Source de stress. -Prélèvements sanguins intermédiaires sur animaux éveillés : Source de stress, qui sera considérablement réduite par le geste expert du manipulateur. -sacrifice par injection létale : Source de stress au moment de l’injection intrapéritonéale.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
En fin de procédure, tous les animaux seront mis à mort pour réaliser les prélèvements tissulaires en post-mortem (voir 5.6.1).
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Pour mener à bien nos projets, nous réalisons en amont de nos procédures toute une série de tests in vitro. Cette première série de tests permet notamment de vérifier le maintien de la liaison avec le récepteur cellulaire cible, mais en aucun cas de prendre en compte l’intégralité des paramètres physiologiques (mécanistiques, immunitaires, métaboliques et d’éliminations) qui conditionnent le succès de nos vecteurs conjugués. Pour faire face à cette sélection physiologique, nous envisagerons donc de réaliser nos expériences sur le petit animal de laboratoire, ici la souris, 1er modèle animal disponible se rapprochant de l’homme pour l’étude des mécanismes physiologiques in vivo. Il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle prédictif de bio-informatique capable d’apporter toutes les réponses aux problématiques de la pharmacocinétique, ou suffisamment informel tel que les organoïdes (micro-tissus en culture chargés de reproduire le fonctionnement d’un organe). Le modèle vivant, ici la souris, reste pour l’instant le seul système physiologique qui intègre la complexité de l’ensemble des paramètres mécanistiques et homéostasiques précédemment cités, indispensables à l’étude d’une efficacité pharmacologique chez les mammifères. Dans notre cas, le principal désavantage concerne donc le recours à l’utilisation d’animaux. Il s’agit alors de définir à minima et au plus juste le nombre d’individus. L’utilisation de faibles cohortes d’animaux permettra d’aller en ce sens, tout en allant exploiter un maximum de résultats et par l’obtention de données statistiques significatives.
2. Réduction
L’optimisation de nos molécules et l’injection intra-cérébrale permettent d’envisager une médication optimisée et réduite (dose infime par animal), de limiter les possibles effets secondaires, mais aussi le nombre d’individus au sein de la procédure (Réduction). Le nombre total d’animaux sera réparti sur de petits groupes de n=4 (2 mâles/2 femelles), à raison de maximum 8 groupes par étude et 5 études par an, sur le fond standard et sur la lignée humanisée, nous n’aurons besoin que de 320 animaux par an, soit un total de 1600 souris sur 5 ans. Il est important de noter que ce nombre total d’animaux sera mixte à 50/50 entre mâles et femelles (cages séparées). Pour une analyse statistique, le faible « n » (4 individus), sera suffisant et nous orientera vers des modèles non-paramétriques. Sur de l’expérimentation in vivo, tous les paramètres ne sont pas maîtrisés, et sont basés sur des populations aléatoires de souris ou chaque animal présente des variables individuelles. Nous pourrons réaliser un équivalent du test d’homogénéité entre groupes, ou encore une analyse de variance. En fin de procédure, une liste ciblée de tissus à prélever nous évitera une utilisation abusive et inutile des souris et permettra d’optimiser la procédure sur plusieurs types de post-expérimentations. La réalisation de prélèvements sanguins intermédiaires en cours de cinétique permet d’obtenir des données de stabilités pharmacologiques supplémentaires, ce qui va également dans le sens d’une optimisation et réduction du nombre d’animaux.
3. Raffinement
La formation initiale et l’expérience du personnel sont nécessaires pour appréhender les moindres signes et/ou comportements caractéristiques d’une douleur ou gène chez l’animal. Nous porterons une attention particulière à la préparation amont de l’expérimentation. Elle regroupe l’ensemble des préparatifs, l’adaptation, le conditionnement et la stabulation des animaux, laquelle sera au minimum de 7 jours (fond standard) voire 14 jours (lignée humanisée) dès réception. 48h à 72h avant les administrations, les souris sont sorties de l’animalerie dans une pièce spécialisée. Elles sont ainsi maintenues dans un contexte familier. Par la suite, les animaux seront tondus (partie supérieure du crâne) la veille des administrations (sous anesthésie gazeuse) pour éviter l’accumulation des anesthésies le jour même (J0) et le stress associé. A J0, les administrations intra-cérébrales seront réalisées sous anesthésie. Les manipulations sur animal éveillé, en cours d’étude, seront précises et rapides (≤ 2min). Une couveuse chauffante (env.37°C) sera utilisée pour assurer le bon réveil lors de la phase post-opératoire et une attention quotidienne (nettoyage vétédine savon) sera portée durant 72h à 1 semaine (fonction avancement cicatrisations) pour assurer une bonne cicatrisation et récupération des animaux. Des points limites seront malgré tout établis en cours de chirurgie, puis lors du réveil et tout au long de la cinétique. Tout comme son contrôle standard, la lignée humanisée utilisée n’a jusqu’alors jamais présenté d’apparitions de phénotypes dommageables.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
-Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d’utilisation et d’élevage, pratique pour les études de pharmacologies et comportementales, elle est donc idéale pour la mise en place de premières études précliniques. A l’heure actuelle, faute d’alternatives de remplacement, le modèle rongeur, ici la souris, reste le seul modèle accessible de « petit mammifère » dont la physiologie est bien connue et relativement proche de l’homme. Par sa petite taille, Il devient également très intéressant pour la balance pharmacologie/toxicologie (bénéfices/risques) et une diminution des posologies. Notre modèle de transposition sur la lignée humanisée est particulièrement avantageux car il présente une cible endogène humanisée (récepteurs) tout en gardant les avantages cités précédemment. Les données obtenues sur ce modèle permettront notamment une extrapolation plus pertinente au modèle humain, d’envisager un gain de temps dans le développement futur du projet, mais aussi, d’éviter un certain nombre d’études et une utilisation significative d’animaux. Les animaux seront utilisés pour réaliser des validations pharmacologiques centrales et des échantillonnages de sang et tissus. -Pour notre procédure et nos deux lignées utilisées, nous utiliserons des animaux dits « jeunes adultes », ayant une moyenne de 10 à 12 semaines. A cet âge, nous limitons ainsi les variations inter-individus qui peuvent avoir un impact sur les mécanismes physiologiques et les modulations de l’expression de certaines protéines. Cet âge présente un poids moyen de 27-30g environ, ce qui s’avère plus intéressant en termes de posologies (réduction des doses).