Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 2024-01-19 00:00:00
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-845268)
1340 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des régimes carencés ou enrichis en gras et sucre pendant seize semaines, des injections répétées, des gavages, et 90 d’entre elles une chirurgie d’accès aux ganglions et au tissu adipeux, avant prélèvement des organes. Le porteur répertorie une gêne à l’administration, des variations de poids et une douleur modérée liée à la chirurgie soulagée par antalgiques. Il affirme que les expériences in vivo sont « absolument essentielles » faute de système in vitro assez complexe.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Note de l'OXA. Cette question est celle du formulaire européen de résumé non technique. Elle est posée au laboratoire qui demande l'autorisation, et sa réponse est écrite avant que la première procédure commence (arrêté du 1er février 2013, art. 5). Ces objectifs servent à justifier l'utilisation des animaux devant le comité d'éthique. Aucun document public ne dira ensuite s'ils ont été atteints : la directive permet aux États de faire mettre à jour le résumé avec les résultats de l'appréciation rétrospective (directive 2010/63/UE, art. 43), la base européenne prévoit de les recevoir, et aucune entrée française n'en porte (base ALURES).
Ce projet s’intéresse au rôle du microenvironnement immunitaire des organes périphériques comme le foie et l’intestin en conditions physiologiques et au cours de l’inflammation. L’inflammation s’accompagne de modifications des cellules immunitaires au voisinage du site d’inflammation et même jusqu’aux organes plus centraux producteurs de nouvelles cellules effectrices. Pour comprendre la régulation cellulaire et moléculaire de la réponse des cellules immunitaires dans l’intestin et le foie lors de stimuli inflammatoires, les souris sont mises dans des contextes de régimes alimentaire inflammatoires (MCD) et un régime gras et sucré (High-fat High glucose Diet, HFHG). Globalement, les désordres tissulaires engendrés par ces stimulations vont modifier le comportement des cellules immunitaires en agissant à différents niveaux (métabolisme, survie, prolifération, activation…). Ainsi, les cellules immunitaires seront étudiées pour leur propriété de prolifération, différenciation, de motilité et de circulation au niveau des organes primaires du système immunitaire (thymus et moelle osseuse), des organes lymphoïdes secondaires (ganglions, rate, plaques de Peyer) ainsi qu’au niveau des organes périphériques (poumons, l’intestin, le foie et le tissu adipeux). L’étude de la réponse immunitaire des différentes populations impliquées dans l’inflammation tissulaire, permettra de cibler les processus cellulaires et moléculaires mis en place par le système immunitaire en parallèle des modifications globales corporelles et systémiques (infiltration tissulaire, réponse systémique pathophysiologique avec l’analyse des caractéristiques hématologiques, biochimiques, cytologiques et histologiques). L’étape suivante consistera en l’analyse de molécules permettant de moduler la réponse inflammatoire et d’évaluer leur potentiel thérapeutique et leur mode d’action sur les cellules immunitaires et la répercussion sur l’état inflammatoire tissulaire.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Note de l'OXA. Le formulaire européen demande les bénéfices « susceptibles de découler » du projet. Il appelle donc une projection, et il l'obtient : ce que le laboratoire écrit ici est ce qu'il espère, avant d'avoir commencé. Deux chercheuses ont repris six corpus d'études précliniques déjà menées et pesé les dommages réellement infligés aux animaux contre les bénéfices cliniques réellement obtenus : moins de 7 % de ces études ressortaient défendables (Pound et Nicol, 2018).
Ce projet permet de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires mis en place lors d’inflammation tissulaire au cours de pathologies de type stéatose non alcoolique. A court terme, ce projet scientifique permettra de comprendre ce qui régit l’accumulation de certaines populations immunitaires dans le foie et l’intestin à la suite des inflammations causées par des régimes alimentaires spécifiques. Cela devrait renseigner sur les mécanismes moléculaires mis en jeu dans les tissus en inflammation pour réparer ou amplifier la stéato-hépatite et l’implication des modifications métaboliques associées comme l’insulinorésistance. Le rôle des différentes populations immunitaires sur l’évolution de la pathologie du foie et la perméabilité intestinale associée est encore mal compris. Cependant, des études indiquent que ces populations immunitaires seraient cruciales pour lutter contre une mise en place de modifications irréversibles, comme la fibrose. De plus, nous étudierons si ces processus relancent une hématopoïèse et quels en sont les mécanismes moléculaires associés. A long terme, ces données moléculaires sur l’inflammation pourraient représenter une source importante de moyens thérapeutiques avec des actions supplémentaires pour lutter contre l’évolution de la pathologie de type stéato-hépatite. Le nombre de cas est en constante progression au vu de l’augmentation mondiale de l’obésité qui y est associée.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Note de l'OXA. La formule « en règle générale » autorise une réponse générale, et c'est l'un des points sur lesquels les examens de qualité trouvent ces documents défaillants. Cruelty Free International a établi en 2018 que les résumés allemands et britanniques, les seuls examinés à ce jour, décrivaient mal ce qui est fait aux animaux et ce que ceux-ci pourraient éprouver (Taylor et al., 2018). L'adoption d'un modèle commun européen a nettement amélioré le premier point, à peine le second (Taylor et al., 2024).
Les interventions sont: Un régime riche en gras et en sucre donné sur une période de 16 semaines à un grand nombre des souris en parallèle de leur contrôle sous régime alimentaire « normal ». Des injections intra-péritonéales (ip) (quelques secondes) tous les 5 jours pendant un maximum de 8 semaines. Des injections ip (quelques secondes) réalisées quotidiennement pendant 7 jours sur d’autres lots de souris. Une seule injection en ip (quelques secondes) sera réalisée soit 10H ou 24H avant la mise à mort. Un gavage de 2 minutes en 1 seule fois par animal sera suivi d’un dosage sanguin de quelques secondes sur une cinétique de 1, 3 et 5 heures pour certains animaux ou de 5, 15, 30, 60, 90, et 120 min pour les autres (quelques gouttes sur bandelettes). 90 animaux subiront une procédure chirurgicale (avec un maximum de 10min) permettant d’accéder aux ganglions et tissu adipeux. Des antalgiques sont administrés en pré et post opératoire et la chirurgie se fait sous anesthésie gazeuse.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Note de l'OXA. C'est l'endroit du document où les animaux devraient apparaître, et c'est celui qui résiste. Cruelty Free Europe a mesuré en 2024 que cinq des six éléments attendus sur les dommages prévus progressaient depuis l'adoption d'un modèle commun européen. Les effets indésirables sont le sixième : 41 % des résumés allemands et 48 % des britanniques les décrivent complètement. Les auteurs relèvent aussi des effets présentés comme minimes sur des projets classés modérés ou sévères (Taylor et al., 2024). Ces deux pays sont les seuls dont les résumés ont été examinés. Les résumés français relèvent du même modèle européen, et leur qualité n'a jamais été mesurée.
Nous avons répertorié 4 points de nuisances qui sont les suivants : 1- Une gêne légère liée à l’administration et/ou les prélèvements effectués. 2- Une perte de poids légère à modérée à la suite du régime alimentaire déficient en Methionine et choline (MCD). 3- Une prise de poids légère à modérée à la suite du régime alimentaire enrichi en gras et en sucre (High-fat High glucose Diet, HFHG). 4- Une douleur modérée liée à la chirurgie et améliorée par la prise d’antalgiques.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Note de l'OXA. Le formulaire demande de justifier ce sort, non de le décrire. L'analyse dommage-avantage que la directive impose au comité d'éthique porte sur « la souffrance, la douleur et l'angoisse » infligées aux animaux (directive 2010/63/UE, art. 38). Quand ce sort est la mise à mort, celle-ci ne figure donc pas parmi les dommages que le comité met en balance avec les bénéfices annoncés. L'OXA écrit « mise à mort » plutôt que « sacrifice », qui emprunte au registre du don consenti, ou « euthanasie », qui désigne une mort décidée dans l'intérêt de celui qui meurt.
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils sont tous utilisés pour prélèvement de leurs organes et l’isolement des populations immunitaires dans les différents tissus.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Note de l'OXA. La directive demande au résumé « une démonstration de la conformité » aux exigences de remplacement, de réduction et de raffinement (directive 2010/63/UE, art. 43). C'est donc le demandeur qui démontre sa propre conformité, dans le document même qui sollicite l'autorisation. Cette démonstration peut prendre la forme d'une affirmation qu'aucune méthode de substitution n'existe, que le document n'a pas à sourcer. Ces trois exigences sont par ailleurs subordonnées à l'objectif du projet : elles cherchent à remplacer les animaux dans un projet donné, elles n'interrogent pas ce projet.
La réponse des populations immunes à des signaux inflammatoires tissulaires, donc provenant du dialogue entre divers sous-types cellulaires dans différents organes est très contrôlée. Les cellules passent par une circulation sanguine et lymphatique qui sont des environnements complexes et impossible à mimer sur des tests in vitro. Afin de pouvoir conclure sur des fonctions différentielles de nos cellules et de comprendre les mécanismes moléculaires en jeu, les expériences in vivo sont absolument essentielles et aucun système in vitro assez complexe n’existe pour obtenir ces résultats. Pour les études dans une seconde étape, toutes les simulations d’activation cellulaire par des cytokines seront entreprises en culture afin d’éviter l’utilisation d’animaux dans le cas de questions mécanistiques.
2. Réduction
Note de l'OXA. La réduction dont il est question ici porte sur le nombre d'animaux par groupe expérimental, calculé pour que l'analyse statistique tienne. Le total annoncé dans la fiche est une estimation portant sur une autorisation de cinq ans au maximum (code rural, art. R214-123) : il ne dit pas combien d'animaux seront effectivement utilisés, et il ne se rapporte pas à une année.
Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires, notre étude ne prendra en compte que des points de temps bien précis pour la cinétique car les effets du régime sont déjà décrits dans la littérature et nous avons aussi le recul nécessaire avec notre précédent projets sur les mêmes régimes alimentaires. Par exemple, nous savons que l’insulinorésistance et la résistance au glucose ne sont à tester qu’à partir de la 12ème semaine de régime pour des souris sauvages. Les mécanismes cellulaires et leurs modulations ne seront analysés qu’aux stades précis de la cinétique correspondant aux points de temps avec des différences significatives des populations immunitaires détectées lors de la première procédure du projet. De plus, la compilation de données de la littérature et de données déjà générées au laboratoire (sur animal non manipulé), ainsi que des expériences de culture cellulaire nous permettent de limiter le nombre d’hypothèses à tester. Enfin, le nombre de souris à utiliser a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats. De plus, nous aurons des résultats des procédures qui s’enchainent qui permettront d’éliminer des hypothèses concernant l’implications de certaines populations et/ou molécules. Ainsi, le nombre d’analyse à faire sera réduit par rapport à ce qui a été anticipé en prenant en compte toutes les lignées utilisées à la procédure précédente sans tenir compte de la significativité des résultats. Pour les tests statistiques, nous avons évalué nos nombres finaux à analyser selon les comparaisons à faire entre les variables et selon un niveau de risque fixé à 0.01 et une puissance fixée à 0.66. Quand cela était nécessaire, nous avons appliqué un possible effet cage et donc pondéré par le facteur correspondant. Seulement dans les conditions adéquates (point de cinétique précis) où l’augmentation du taux circulant des cellules immunes est validé, une étude du blocage des molécules de circulation se fera par l’injection des anticorps bloquants. Nous vérifierons ainsi en étudiant le tissu cible si les populations bloquées avaient plutôt un effet pro-inflammatoire ou réparateur. Appliquer les bloquants uniquement dans le cas d’une circulation statistiquement signifiante permet de réduire les effectifs requis et visera à réduire le nombre de souris nécessaires pour maintenir une interprétation biologique robuste.
3. Raffinement
Note de l'OXA. Le raffinement nomme une amélioration technique de la procédure, sans dire ce qu'elle change pour l'animal qui la subit. La réglementation impose d'atténuer la douleur, dans une limite qu'elle inscrit elle-même : « pour autant que cela soit compatible avec la finalité de la procédure expérimentale » (code rural, art. R214-109). Ce qui reste de souffrance après cette limite est autorisé. Le raffinement ne porte par ailleurs que sur la procédure : les souffrances de la captivité elle-même, confinement, bruit, lumière, manipulations d'entretien, ne relèvent d'aucun des trois R.
Les animaux sont manipulés sur plusieurs jours avant le début des expériences car ils sont souvent pesés et cela limite leurs stress de suivre cette habitude d’interactions. Une fiche d’observation tout au long des régimes permettra de vérifier leur état (pelage, poids, respiration, mobilité…) et des scores seront tenus afin de vérifier que le traitement n’induit pas de modifications des habitudes et du bien-être animal. En cas de changement des scores, des points limites sont établis (perte de poids rapide, modification aspect pelage/alopécie, déshydratation, changement de consistance/couleur des selles) et le suivi rapproché des animaux permettra de définir s’il est nécessaire de – diminuer la dose et/ou d’administrer un analgésique selon la gravité des changements de comportement. Ces conditions s’appliquent à toutes les procédures. Pour la plupart des procédures, les animaux sont mis à mort très peu de temps après le geste invasif. Quand les animaux sont conservés en vie, un suivi quotidien s’assurera de leur bien-être et pour surveiller les éventuels signes de souffrance ou de stress selon la grille de score précédemment décrite dans ce paragraphe.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Note de l'OXA. Le dossier d'autorisation demande de justifier l'origine des animaux, leur espèce, leur nombre estimé et leur stade de développement (arrêté du 1er février 2013, art. 5). La justification attendue est technique : elle porte sur l'adéquation de l'espèce à l'objectif poursuivi. Ce que l'appartenance à une espèce autorise à faire subir à un individu est une question morale, et le formulaire ne la pose pas. L'appartenance à une espèce, prise seule, ne fonde pourtant pas de différence de statut moral entre des individus également capables de souffrir.
La souris de laboratoire, mammifère modèle, comporte tous les composants moléculaires et cellulaires clés du système immunitaire : l’analyse des nombreux lignages qui contribuent à la structure et aux fonctions complexes du système immunitaire des souris est précieuse pour appréhender la structure et les fonctions du système immunitaire humain. De plus, il existe un grand nombre de lignées de souris mutantes et transgéniques, qui permettent des études mécanistiques approfondies. Le recours à ces souris génétiquement modifiées va nous permettre d’identifier et de caractériser les processus sous-tendant la stéato-hépatite. Le détail du nombre d’animaux par procédure est mentionné dans le protocole. Toutes les souris seront analysées à l’âge adulte et les régimes débutés chez le jeune adulte âgé de 6 semaines. Cette date a été retenue comme la plus significative pour observer la mise en place et le suivi de la stéatose chez la souris. C’est le stade le plus précoce auquel les souris ont un poids assez stable et assez important pour en perdre suite au régime . De plus, comme le régime se pratique sur au moins 16 semaines, les souris doivent être prises à un stade qui évite qu’elles ne soient trop vieilles après le régime et que l’on ne soit pas sur l’interprétation d’un facteur vieillissement.