Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 2024-04-08 00:00:00
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-149304)
Pour mesurer comment l’hyperglycémie freine la réparation du cerveau, 280 poissons zèbres adultes vont être utilisés, tous tués à l’issue pour analyse de leurs tissus. 140 relèvent de procédures menées sous anesthésie sans réveil, 140 d’un niveau de souffrance léger. Une partie des animaux passe quatorze jours immergée dans une eau sucrée à 20 grammes de glucose par litre, renouvelée deux fois par jour, et 140 subissent une lésion du cerveau sous anesthésie, l’acte durant moins de quinze secondes. Le porteur n’attend aucune nuisance notable tout en reconnaissant que la littérature ne rapporte pas cette information, et fixe comme points limites des nages en cercle, une flottabilité anormale, une couleur anormale ou l’incapacité de se nourrir.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Note de l'OXA. Cette question est celle du formulaire européen de résumé non technique. Elle est posée au laboratoire qui demande l'autorisation, et sa réponse est écrite avant que la première procédure commence (arrêté du 1er février 2013, art. 5). Ces objectifs servent à justifier l'utilisation des animaux devant le comité d'éthique. Aucun document public ne dira ensuite s'ils ont été atteints : la directive permet aux États de faire mettre à jour le résumé avec les résultats de l'appréciation rétrospective (directive 2010/63/UE, art. 43), la base européenne prévoit de les recevoir, et aucune entrée française n'en porte (base ALURES).
Le diabète est une maladie caractérisée par une hyperglycémie chronique (glycémie à jeun supérieure à 1,26g/L). Cette pathologie constitue un enjeu majeur de Santé Publique à l’échelle mondiale car sa prévalence augmente depuis plusieurs décennies. De façon intéressante, il a été démontré que le diabète/hyperglycémie était associé à une perturbation de l’homéostasie cérébrale (trouble de la mémoire, perte de substance grise) favorisant les accidents vasculaires cérébraux et aggravant leurs conséquences neurologiques. Ainsi, la condition d’hyperglycémie semble être délétère pour le fonctionnement du cerveau. Plus largement, lors des dommages cérébraux, l’hyperglycémie/diabète a un impact négatif sur la taille des lésions et la récupération fonctionnelles (élocution, locomotion, sensibilité, …). Cependant, les impacts réels de l’hyperglycémie sur les mécanismes propres à la réparation cérébrale ne sont pas bien connus. Les objectifs du projet sont de comprendre l’impact de l’hyperglycémie sur les mécanismes de réparation cérébrale en utilisant le poisson zèbre. Cet animal est un modèle reconnu de plasticité et de réparation cérébrales. C’est aussi un modèle permettant de mimer des situations d’hyperglycémies chroniques. Dans ce contexte, nos sous-objectifs sont de déterminer l’impact de l’hyperglycémie sur la mort cellulaire à la suite d’une lésion cérébrale, (2) sur l’angiogenèse régénérative (création de nouveaux vaisseaux), (3) sur le recrutement de la microglie (cellule immunitaire du cerveau) au site de la lésion, et enfin (4) la neurogenèse régénérative permettant de générer de nouveaux neurones pour remplacer ceux qui sont morts à la suite de la lésion.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Note de l'OXA. Le formulaire européen demande les bénéfices « susceptibles de découler » du projet. Il appelle donc une projection, et il l'obtient : ce que le laboratoire écrit ici est ce qu'il espère, avant d'avoir commencé. Deux chercheuses ont repris six corpus d'études précliniques déjà menées et pesé les dommages réellement infligés aux animaux contre les bénéfices cliniques réellement obtenus : moins de 7 % de ces études ressortaient défendables (Pound et Nicol, 2018).
Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu et affectés par l’hyperglycémie lors d’un dommage cérébral. Il pourrait permettre d’identifier des problèmes de réparation induite par l’hyperglycémie (ex: suractivation microgliale, problème d’activation des cellules souches). Ainsi, cette meilleure compréhension du fonctionnement régénératif en condition hyperglycémique pourrait permettre de mettre en œuvre des thérapies favorisant ou limitant ces processus (ex: limiter la mort cellulaire, limiter la neuroinflammation, favoriser la neurogenèse). A terme, ce projet a pour but de favoriser la réparation cérébrale dans des conditions qui lui sont délétères (ex: hyperglycémie) afin de limiter les conséquences de dommages cérébraux.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Note de l'OXA. La formule « en règle générale » autorise une réponse générale, et c'est l'un des points sur lesquels les examens de qualité trouvent ces documents défaillants. Cruelty Free International a établi en 2018 que les résumés allemands et britanniques, les seuls examinés à ce jour, décrivaient mal ce qui est fait aux animaux et ce que ceux-ci pourraient éprouver (Taylor et al., 2018). L'adoption d'un modèle commun européen a nettement amélioré le premier point, à peine le second (Taylor et al., 2024).
La moitié des animaux (soit 70) sera plongée dans de l’eau contenant du D-glucose (20g/L) afin de mettre en place une hyperglycémie chronique chez ces derniers. Ce traitement est effectuée pendant une période de 14 jours. La solution eau/D-glucose dans laquelle sont immergés les animaux est renouvellée 2 fois par jour (une fois le matin et une fois le soir). L’eau des animaux contrôles est également changée deux fois par jour pour respecter les mêmes contraintes expérimentales (cela se fera donc sur les 70 animaux contrôles). Les animaux seront soumis à des lésions cérébrales (140 animaux) avant la fin de l’expérimentation pour étude de la mort cellulaire induite par la lésion cérébrale (1 jour après lésion, soit lésion à J13), de l’angiogenèse et réactivité des microglies (2 et 3 jours après lésion, soit lésion à J11 et J12) et neurogenèse (3 jours après lésion, soit lésion à J11). La durée de la lésion est de moins de 15 secondes une fois l’animal anesthésié. La durée totale anesthésie, lésion et réveil est inférieure à 5 minutes.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Note de l'OXA. C'est l'endroit du document où les animaux devraient apparaître, et c'est celui qui résiste. Cruelty Free Europe a mesuré en 2024 que cinq des six éléments attendus sur les dommages prévus progressaient depuis l'adoption d'un modèle commun européen. Les effets indésirables sont le sixième : 41 % des résumés allemands et 48 % des britanniques les décrivent complètement. Les auteurs relèvent aussi des effets présentés comme minimes sur des projets classés modérés ou sévères (Taylor et al., 2024). Ces deux pays sont les seuls dont les résumés ont été examinés. Les résumés français relèvent du même modèle européen, et leur qualité n'a jamais été mesurée.
Des expériences précédentes sur les modèles de lésions chez le poisson zèbre n’ont pas révélé de nuisances notables (ex: surmortalité, troubles du comportement, stress, douleur). Il en est de même sur les modèles d’hyperglycémie chez le poisson zèbre. Aussi, même si des lésions cérébrales chez le poisson zèbre hyperglycémique pourraient impacter certains processus régénératifs, nous n’attendons pas de nuisances et/ou effets indésirables par rapport aux données précédentes de la littérature pour lesquelles ces informations importantes n’ont pas été rapportées, ni même observées au laboratoire.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Note de l'OXA. Le formulaire demande de justifier ce sort, non de le décrire. L'analyse dommage-avantage que la directive impose au comité d'éthique porte sur « la souffrance, la douleur et l'angoisse » infligées aux animaux (directive 2010/63/UE, art. 38). Quand ce sort est la mise à mort, celle-ci ne figure donc pas parmi les dommages que le comité met en balance avec les bénéfices annoncés. L'OXA écrit « mise à mort » plutôt que « sacrifice », qui emprunte au registre du don consenti, ou « euthanasie », qui désigne une mort décidée dans l'intérêt de celui qui meurt.
A la fin de l’expérimentation, tous les animaux seront euthanasiés pour analyse tissulaire par immunohistochimie.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Note de l'OXA. La directive demande au résumé « une démonstration de la conformité » aux exigences de remplacement, de réduction et de raffinement (directive 2010/63/UE, art. 43). C'est donc le demandeur qui démontre sa propre conformité, dans le document même qui sollicite l'autorisation. Cette démonstration peut prendre la forme d'une affirmation qu'aucune méthode de substitution n'existe, que le document n'a pas à sourcer. Ces trois exigences sont par ailleurs subordonnées à l'objectif du projet : elles cherchent à remplacer les animaux dans un projet donné, elles n'interrogent pas ce projet.
La complexité des processus physiologiques se déroulant lors de la réparation cérébrale ne sont pas modélisables par des techniques in vitro. Les processus de réparation impliquent plusieurs types cellulaires: microglies, oligodendrocytes, macrophages, cellules endothéliales, neurones, et cellules souches neurales. De plus, plusieurs processus physiologiques se mettent en place lors de la réparation : hypoxie, inflammation, stress oxydatif, sécrétion de facteurs trophiques et neurotrophiques ainsi qu’endothéliaux. A l’heure actuelle, nous ne pouvons réaliser des procédures in vitro permettant d’intégrer l’ensemble de ces acteurs cellulaires et de signalisation.
2. Réduction
Note de l'OXA. La réduction dont il est question ici porte sur le nombre d'animaux par groupe expérimental, calculé pour que l'analyse statistique tienne. Le total annoncé dans la fiche est une estimation portant sur une autorisation de cinq ans au maximum (code rural, art. R214-123) : il ne dit pas combien d'animaux seront effectivement utilisés, et il ne se rapporte pas à une année.
Chaque expérimentation sera scindée dans la mesure du possible en deux expériences indépendantes. Cela permettra de ne pas utiliser l’ensemble des animaux si nous observons que les résultats obtenus sont suffisamment étayés. De plus, si jamais une souffrance ou une mortalité inattendue venait à apparaitre, cela éviterait de relancer une expérimentation avec le deuxième groupe d’animaux. De part notre expérience et les données de la littérature, de tels effectifs permettent de fournir des données statistiques solides. Nous réaliserons des tests statistiques (t-test) pour déterminer la significativité de nos résultats.
3. Raffinement
Note de l'OXA. Le raffinement nomme une amélioration technique de la procédure, sans dire ce qu'elle change pour l'animal qui la subit. La réglementation impose d'atténuer la douleur, dans une limite qu'elle inscrit elle-même : « pour autant que cela soit compatible avec la finalité de la procédure expérimentale » (code rural, art. R214-109). Ce qui reste de souffrance après cette limite est autorisé. Le raffinement ne porte par ailleurs que sur la procédure : les souffrances de la captivité elle-même, confinement, bruit, lumière, manipulations d'entretien, ne relèvent d'aucun des trois R.
Les animaux seront observés plusieurs fois par jour dans leur milieu contrôle et/ou hyperglycémique. Après lésion, ils seront observés de façon intensive dans les premières 30 minutes, puis une fois toutes les heures. Tout signe de souffrance ou de comportement anormal sera rapporté au vétérinaire référent afin de prendre les mesures adéquates. Un espace suffisant limitant au maximum les contraintes subies et permettant un comportement normal sera assuré. Les procédures invasives seront réalisées sous anesthésie générale par une personne qualifiée. Différents points limites spécifiques tels qu’un comportement anormal (mouvements circulaires), nutrition anormale (voire incapacité à se nourrir), flottabilité anormale, couleur anormale seront analysés. Si un de ces paramètres ou points limites est atteint, nous en ferons part au vétérinaire pour arrêt de l’expérimentation et par conséquent euthanasie pour limiter les souffrances de l’animal (sédation profonde puis euthanasie). Les données bilbiographiques et notre expérience ne montre pas de signes de souffrance, stress, modifications majeures du comportement alimentaire et locomoteur à la suite de la balnéation dans le glucose ou de la lésion. Nous resterons néanmoins vigilants sur l’ensemble des points limites.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Note de l'OXA. Le dossier d'autorisation demande de justifier l'origine des animaux, leur espèce, leur nombre estimé et leur stade de développement (arrêté du 1er février 2013, art. 5). La justification attendue est technique : elle porte sur l'adéquation de l'espèce à l'objectif poursuivi. Ce que l'appartenance à une espèce autorise à faire subir à un individu est une question morale, et le formulaire ne la pose pas. L'appartenance à une espèce, prise seule, ne fonde pourtant pas de différence de statut moral entre des individus également capables de souffrir.
Le poisson zèbre partage de 70 à 85 % de gènes en commun avec l’espèce humaine, impliqués dans les processus physiologiques et pathophysiologiques, respectivement. La situation diabétique (d’hyperglycémie) peut être mimée en mettant les animaux dans de l’eau supplémentée en D-glucose. De plus, c’est également un modèle de réparation cérébrale reconnu avec des processus de réparation similaires à ceux des mammifères. Animaux adultes entre 3 mois et 18 mois. A ces stades, les activités neurogéniques sont globalement similaires.