Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 2024-07-02 00:00:00
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-079483)
Quatre injections dans le muscle à sept jours de vie, sous anesthésie, puis pour une partie des souris une mesure de l’activité électrique du nerf de trente minutes et une mesure de contractilité musculaire de vingt-cinq minutes. 812 souris vont être utilisées, 584 porteuses de la dystrophie musculaire de Duchenne et 228 témoins, toutes tuées à l’issue pour les prélèvements. Le porteur décrit chez les souris malades de l’anxiété, une crise inflammatoire de trois semaines, une faiblesse musculaire à deux mois, un pelage terne et le dos vouté à trois mois, une atteinte de l’audition à cinq mois, et déclare pourtant 776 de ces 812 animaux en niveau de souffrance légère. Le facteur de croissance testé pourrait, à long terme, compléter les thérapies géniques en cours de développement chez les patients.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Note de l'OXA. Cette question est celle du formulaire européen de résumé non technique. Elle est posée au laboratoire qui demande l'autorisation, et sa réponse est écrite avant que la première procédure commence (arrêté du 1er février 2013, art. 5). Ces objectifs servent à justifier l'utilisation des animaux devant le comité d'éthique. Aucun document public ne dira ensuite s'ils ont été atteints : la directive permet aux États de faire mettre à jour le résumé avec les résultats de l'appréciation rétrospective (directive 2010/63/UE, art. 43), la base européenne prévoit de les recevoir, et aucune entrée française n'en porte (base ALURES).
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie génétique à transmission récessive liée au chromosome X due à l’absence de la protéine dystrophine. Cette maladie entraîne une dégénérescence de l’ensemble des muscles (squelettique, cardiaque ou lisse), une inflammation, de la fibrose et une perte de masse et de force musculaire. Il n’existe pas à ce jour de traitement pour la DMD mais des stratégies de thérapie génique prometteuses sont en cours d’évaluation dans des essais cliniques. Parmi les approches de thérapie génique, la restauration de la protéine dystrophine est la plus prometteuse. Néanmoins, nous savons aujourd’hui que la restauration de dystrophine devra s’accompagner d’une stratégie permettant un meilleur maintien de l’intégrité musculaire. En effet, chez les patients DMD, les fibres dépourvues de dystrophine se cassent et dégénèrent. La force musculaire diminue et le tissu musculaire laisse la place aux tissus conjonctif et graisseux. Les stratégies thérapeutiques sont confrontées à des limites comme la dégénérescence des fibres musculaires dystrophiques et la perte du bénéfice thérapeutique. Dans cette optique, nous envisageons de poursuivre nos investigations sur les mécanismes moléculaires mis en jeu suite à l’injection d’un facteur de croissance qui possède un réel potentiel thérapeutique en améliorant l’intégrité du muscle dystrophique.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Note de l'OXA. Le formulaire européen demande les bénéfices « susceptibles de découler » du projet. Il appelle donc une projection, et il l'obtient : ce que le laboratoire écrit ici est ce qu'il espère, avant d'avoir commencé. Deux chercheuses ont repris six corpus d'études précliniques déjà menées et pesé les dommages réellement infligés aux animaux contre les bénéfices cliniques réellement obtenus : moins de 7 % de ces études ressortaient défendables (Pound et Nicol, 2018).
Nous attendons, comme bénéfices à court terme, une amélioration du phénotype dystrophique lorsque les souris sont traitées avec le facteur de croissance d’intérêt. A long terme, cette molécule pourrait être utilisable chez le patient atteint de dystrophie musculaire de Duchenne en complément des outils de thérapie génique en cours de développement.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Note de l'OXA. La formule « en règle générale » autorise une réponse générale, et c'est l'un des points sur lesquels les examens de qualité trouvent ces documents défaillants. Cruelty Free International a établi en 2018 que les résumés allemands et britanniques, les seuls examinés à ce jour, décrivaient mal ce qui est fait aux animaux et ce que ceux-ci pourraient éprouver (Taylor et al., 2018). L'adoption d'un modèle commun européen a nettement amélioré le premier point, à peine le second (Taylor et al., 2024).
Les animaux seront soumis à plusieurs types d’interventions telles que : 1/ Quatre injections intramusculaires (10 minutes) effectuées sous anesthésie et analgésie à un stade précoce suivies d’une euthanasie par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses. 2/ Quatre injections intramusculaires (10 minutes) effectuées sous anesthésie et analgésie à un stade précoce (10 minutes) associés à deux injections intrapéritonéales sur animal vigile espacées de 24h (1 minute/injection) suivi d’une euthanasie par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses. 3/ Quatre injections intramusculaires (10 minutes) effectuées sous anesthésie et analgésie à un stade précoce suivies d’une mesure ayant pour but de mesurer l’activité électrique des nerfs et des muscles effectuée sous anesthésie et analgésique (30 minutes) et enfin une mesure de la contractilité musculaire sous anesthésie et analgésie (25 minutes) après laquelle les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Note de l'OXA. C'est l'endroit du document où les animaux devraient apparaître, et c'est celui qui résiste. Cruelty Free Europe a mesuré en 2024 que cinq des six éléments attendus sur les dommages prévus progressaient depuis l'adoption d'un modèle commun européen. Les effets indésirables sont le sixième : 41 % des résumés allemands et 48 % des britanniques les décrivent complètement. Les auteurs relèvent aussi des effets présentés comme minimes sur des projets classés modérés ou sévères (Taylor et al., 2024). Ces deux pays sont les seuls dont les résumés ont été examinés. Les résumés français relèvent du même modèle européen, et leur qualité n'a jamais été mesurée.
La souris mdx présente un phénotype dommageable pouvant s’expliquer par un phénotype anxieux, l’apparition d’une crise inflammatoire d’une durée de 3 semaines à 3 semaines de vie et d’une faiblesse musculaire à 2 mois de vie. Certains animaux peuvent avoir un pelage terne et le dos vouté à partir de 3 mois de vie et des problèmes d’audition à partir de 5 mois de vie. Lors du transport entre l’animalerie fournisseur et notre animalerie et à l’arrivée dans leur nouvel environnement, les animaux pourront subir un stress dû aux mouvements des cages de transport, lors de leur transfert dans leur nouvelle cage, pendant les premiers jours après leur arrivée et si l’alimentation n’est pas identique. Au moment des injections intramusculaires et des procédures d’analyse fonctionnelle, les animaux subissent un stress lorsqu’ils sont placés dans la cage à induction pour l’anesthésie gazeuse et une douleur/inconfort équivalent à l’introduction d’une aiguille lors des injections en intrapéritonéal. Suite à l’injection intramusculaire, une gêne et/ou une anomalie au niveau du site d’injection pourrait éventuellement apparaître. De même, lors de la procédure permettant la mesure de l’influx nerveux, des électrodes sont placées en sous-cutané dans le tibialis anterieur, ce qui peut induire une gêne au réveil de l’animal. Au cours de l’anesthésie profonde, les animaux pourraient être victimes d’hypothermie ou d’arrêt cardio-respiratoire suite à l’administration de l’anesthésie.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Note de l'OXA. Le formulaire demande de justifier ce sort, non de le décrire. L'analyse dommage-avantage que la directive impose au comité d'éthique porte sur « la souffrance, la douleur et l'angoisse » infligées aux animaux (directive 2010/63/UE, art. 38). Quand ce sort est la mise à mort, celle-ci ne figure donc pas parmi les dommages que le comité met en balance avec les bénéfices annoncés. L'OXA écrit « mise à mort » plutôt que « sacrifice », qui emprunte au registre du don consenti, ou « euthanasie », qui désigne une mort décidée dans l'intérêt de celui qui meurt.
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses prévues. Les géniteurs seront euthanasiés après 8 mois de vie ou après la génération de 4 portées pour les femelles.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Note de l'OXA. La directive demande au résumé « une démonstration de la conformité » aux exigences de remplacement, de réduction et de raffinement (directive 2010/63/UE, art. 43). C'est donc le demandeur qui démontre sa propre conformité, dans le document même qui sollicite l'autorisation. Cette démonstration peut prendre la forme d'une affirmation qu'aucune méthode de substitution n'existe, que le document n'a pas à sourcer. Ces trois exigences sont par ailleurs subordonnées à l'objectif du projet : elles cherchent à remplacer les animaux dans un projet donné, elles n'interrogent pas ce projet.
Le but de notre projet est l’identification d’une possible stratégie thérapeutique pour le maintien de l’intégrité musculaire dans le muscle dystrophique. L’utilisation d’un modèle murin de la dystrophie musculaire de Duchenne est indispensable car les modèles in vitro ne peuvent rendent compte de la dégénerescence progressive observée au cours de cette maladie. Ce modèle est celui qui est signalé dans les directives pour l’étude de la dystrophie musculaire de Duchenne. Il s’agit du modèle le plus approprié car il est bien caractérisé, avec un phénotype connu et avec beaucoup de littérature à l’appui. La finalité de cette étude est de développer des stratégies thérapeutiques, ce qui ne peut se faire que sur un modèle animal. Néanmoins, autant que possible et si la question posée peut être résolue ainsi, des expériences in vitro avec des lignées cellulaires seront réalisées pour limiter au maximum le recours à l’utilisation de souris.
2. Réduction
Note de l'OXA. La réduction dont il est question ici porte sur le nombre d'animaux par groupe expérimental, calculé pour que l'analyse statistique tienne. Le total annoncé dans la fiche est une estimation portant sur une autorisation de cinq ans au maximum (code rural, art. R214-123) : il ne dit pas combien d'animaux seront effectivement utilisés, et il ne se rapporte pas à une année.
Les processus expérimentaux seront conçus de façon à utiliser un nombre de souris limité. Pour tous les groupes expérimentaux et toutes les méthodes d’analyse, 5 à 8 animaux est un nombre d’échantillons minimum pour obtenir des résultats statistiquement analysables. Néanmoins, considérant une forte hétérogénéité chez les souris dystrophiques, des groupes de 6 à 12 souris par condition seront nécessaires pour permettre une analyse statistique fiable, pour éviter que la variabilité des paramètres de mesures in vivo puisse empêcher la bonne exploitation des résultats. Les protocoles seront rigoureusement élaborés et réfléchis en avance pour que l’expérience soit interprétable et pour éviter de les répéter. Au total, nous prévoyons d’utiliser 812 animaux (584 souris dystrophiques et 228 souris contrôles). La taille des effectifs sera établie grâce à un calcul de puissance et nous procéderons à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.
3. Raffinement
Note de l'OXA. Le raffinement nomme une amélioration technique de la procédure, sans dire ce qu'elle change pour l'animal qui la subit. La réglementation impose d'atténuer la douleur, dans une limite qu'elle inscrit elle-même : « pour autant que cela soit compatible avec la finalité de la procédure expérimentale » (code rural, art. R214-109). Ce qui reste de souffrance après cette limite est autorisé. Le raffinement ne porte par ailleurs que sur la procédure : les souffrances de la captivité elle-même, confinement, bruit, lumière, manipulations d'entretien, ne relèvent d'aucun des trois R.
Nous respecterons une période d’acclimatation de 2 semaines pour les animaux sauvages provenant d’un éleveur extérieur. Les conditions d’hébergement et l’enrichissement du milieu sont gérés par l’animalerie. Elles consistent en un contrôle quotidien des cages, un changement régulier, un nombre réduit d’animaux par cage (5 maximum) et pas d’animaux isolés. Le changement des cages se fait sous hotte aspirante et les cages possèdent des filtres. L’enrichissement du milieu consiste en l’ajout de laine de bois afin que les souris puissent faire un nid ainsi que de lanières de papier Kraft et de tunnels de carton dans les cages d’accouplement. Enfin, si nécessaire, la nourriture pourra être mise à disposition sur le plancher de la cage. Pour limiter la souffrance et l’angoisse, les procédures qui le nécessiteront seront réalisées sous anesthésie et sous analgésiques. Au cours des différentes procédures, la température des souris est maintenue constante à l’aide d’une plate-forme chauffante thermorégulée à 37 degrés. Les animaux seront ensuite suivis quotidiennement afin de relever le moindre signe de souffrance. Nous mettrons en place des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces pour permettre de limiter la douleur à son minimum. Nous procèderons à l’euthanasie compassionnelle de l’animal avant qu’il ne souffre. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel autorisé et compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Note de l'OXA. Le dossier d'autorisation demande de justifier l'origine des animaux, leur espèce, leur nombre estimé et leur stade de développement (arrêté du 1er février 2013, art. 5). La justification attendue est technique : elle porte sur l'adéquation de l'espèce à l'objectif poursuivi. Ce que l'appartenance à une espèce autorise à faire subir à un individu est une question morale, et le formulaire ne la pose pas. L'appartenance à une espèce, prise seule, ne fonde pourtant pas de différence de statut moral entre des individus également capables de souffrir.
Le but de notre projet est la caractérisation de nouvelles voies moléculaires et l’identification de cibles thérapeutiques potentielles pour le maintien de la masse musculaire du muscle dystrophique. La souris présente l’avantage de permettre des études moléculaires et fonctionnelles du muscle squelettique. Le modèle de souris dystrophique utilisé est celui qui est signalé dans les directives pour l’étude de la dystrophie musculaire de Duchenne. Ce modèle est le plus approprié car il est bien caractérisé, avec un phénotype connu et avec beaucoup de littérature à l’appui. Nous utiliserons des souris âgées de 7 jours car nous souhaitons étudier l’impact de la sur-expression de notre facteur de croissance d’intérêt sur le processus de nécrose régénération qui a lieu à 4 semaines de vie. Et nous utiliserons des géniteurs âgés de 2 à 8 mois.