Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 09/07/2024
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-703337)
Privées de deux gènes de l’immunité par édition du génome, des truites arc-en-ciel doivent fournir à la filière truiticole des lignées cellulaires capables de multiplier des virus pour fabriquer des vaccins. 1 504 individus vont être utilisés dans des procédures d’un niveau de souffrance modéré, et le porteur admet que cette perte d’immunité peut les faire souffrir si une infection se déclare. Quatre femelles matures subissent trois séances de pression abdominale, une par jour, pour en extraire les œufs, puis sont tuées parce que l’élevage de grandes truites coûte cher et que les installations ne permettent pas de les garder ensuite. Mille cinq cents alevins subissent un prélèvement de nageoire sous anesthésie pour génotypage, ceux qui ne portent pas la mutation invalidante sont tués, et 125 homozygotes sont envoyés dans un autre laboratoire où des lignées cellulaires seront établies à partir de leurs cellules.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Ce projet vise à mieux comprendre, en les invalidant par modification structurelle ciblée, le rôle de deux gènes de l’immunité dans la réponse antivirale innée des poissons. Ce projet cherche à constituer un savoir théorique dont nous voulons qu’il conduise à des pratiques innovantes au service de la production piscicole. Un des objectifs pratiques de ce projet est d’isoler, à partir d’animaux n’ayant plus ces deux gènes, des lignées cellulaires tolérantes aux virus, ce qui permettrait leur réplication massive in vitro en vue de la production de vaccins antiviraux dont bénéficierait le cheptel truiticole.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Notre projet à pour finalité pratique de contribuer à l’éléboration de vaccins antiviraux en créant des lignées cellulaires génétiquement modifiées capables de propager des virus et donc les antigènes viraux nécessaires à la réponse vaccinale. Il conribuera aussi au dévelopement de méthode de diagnostic viral.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les femelles sexuellement matures (4 au total) subiront sous anesthésie des pressions abdominales afin d’extraire des oeufs qui seront injectés avec des ARNs guide et cas9. Chaque femelle subira 3 séances de pressions abdominales : une séance par jour pendant trois jours consécutifs. Une séance de pression abdominales ne dure jamais plus de trente secondes. Pour déterminer le génotype de chaque alevin (primo injectés, de premère et de seconde génération) un seul prélèvement mineur de la nageoire caudale sera effectué sous anesthésie.Cette opération classiquement réalisée lors d’un génotypage dure quelques secondes et l’alevin est immédiatement remis dans un bac de réveil et son comportement est observé.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Nous ne pouvons pas exclure que des mutations se produisent hors des deux gènes cibles et provoquent un phénotype dommageable sans rapport avec l’immunité. Ce risque est très limité car les sites potentiels de mutagénèse ont été choisis en raison de leur unicité dans le génome lequel est complètement séquencé chez la truite. Par ailleurs, il est possible que la privation des gènes cibles par génie génétique s’accompagne d’une altération de l’immunité qui conduise à une souffrance indésirable des poissons si une pathologie infectieuse se développe, malgré les mesures prophylactiques prises. En ce qui concerne l’anesthésie, elle est très courte : lorsque l’animal manifeste une perte totale d’équilibre et de réaction au toucher, il est rincé à l’eau d’élevage pour limiter la diffusion du produit et le stress physiologique qui pourrait l’accompagner. Le prélèvement d’un fragment de nageoire, qu’implique le génotypage, est réalisé sur un tissu non innervé, il n’y a donc pas de douleur directement liée à ce prélèvement. Enfin, l’isolement transitoire des alevins lors du génotypage peut être aussi un facteur de stress pour ces derniers. Nous limitons sa durée et mettons deux alevins dans un bac qu’une cloison transparente divise en deux compartiments ; de cette manière la perception visuelle d’un congénère est maintenue.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
les truites femelles sexuellement matures subissant le prélèvement des oeufs pour les fécondations in vitro seront euthanasiées. Ces truites seront euthanasiées parce que le coût d’élévage de truites de grande taille (adulte) est élevé et parce que nos structures d’élevage sont trop modestes pour permettre une stabulation des animaux post-expérimentation. Les alevins issus des oeufs injectés et qui ne présentent pas de mutation invalidante seront également euthanasiés selon les procédures en vigueur. Les animaux F0 et les 4 lignées ( première et deuxième génération) sont gardés seulement le temps prévu pour ce projet ; après quoi ils seront également euthanasiées sauf ~ 125 animaux (homozygotes pour une mutation invalidante) qui seront envoyés dans un autre laboratoire pour l’établissement de lignées cellulaires.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’étude fonctionnelle « systémique » d’un gène par invalidation ou modification ciblée de celui-ci ne peut se faire que sur des organismes entiers . Un modèle cellulaire ferait par trop abstraction des régulations supracellulaires (interactions cellulaires multiples) et supratissulaires (regulations endocrines…)
2. Réduction
Réduire : les effectifs (femelles sexuellement matures, embryons injectés et alevins génotypés) sont réduits au maximum pour obtenir 2X 2 lignés F2 distinctes (i.e. présentant des mutations différentes) pour les deux gènes étudiés. Ainsi nous utiliserons seulement 4 femelles ovulantes dont chacune servira à l’obtention de trois pontes successives. De plus nous comptons limiter le pool de sauvegarde des F0 mutants à partir duquel seront générées les lignés F2 à seulement10 individus.
3. Raffinement
Les animaux seront toujours élevés dans les conditions optimales pour l’espèce (photopériode, qualité d’eau, densité et alimentation). Le prélèvement des oeufs se fera sous anesthésie selon une procédure établie et approuvée. Si des animaux (F0, F1 ou F2) devaient présenter une anomalie morphologique ou comportementale alors ils seraient immédiatement mis à mort selon les procédures d’euthanasie en vigueur. Par ailleurs les animaux modifiés par édition du génome (F0, F1 et F2) sont placés dans un milieu enrichi artificiellement qui mime l’environnement naturel notamment en plaçant des leurres végétaux.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La truite arc en ciel (Oncorhynchus mykiss) est une espèce robuste dont l’élevage et la reproduction sont bien maitrisés en pisciculture. L’espèce est grégaire et supporte des densités d’élevage importantes. Il s’agit en outre d’une espèce d’intérêt agronomique représentant 95 % de la production piscicole française. Elle est par ailleurs un modèle biologique largement diffusée dans la communauté scientifique (environ 50 000 références). Plus spécifiquement notre intention est de produire des antigènes viraux dans des lignées cellulaire en vue de la fabrication de préparations vaccinales. Il va de soi que cette entreprise n’est possible que dans des cellules specifiquement permissives à l’infectivité, donc des cellules de truites. La production des oeufs se fera à partir de femelles (4) sexuellement matures et ovulantes. ces oeufs après fécondation, seront injectés avec les outils moléculaires réalisant les modifications génétiques désirées. Le génotypage se fera sur des alevins dérivant d’oeufs injectés (500), de première génération (500) et de seconde génération (500).