Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 10/07/2024
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-753231)
Deux gavages par jour, cinq jours par semaine, pendant quatre semaines, soit jusqu’à quarante administrations forcées par animal, après une infection par Toxoplasma gondii. 931 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, une partie par une chirurgie terminale sous anesthésie profonde pour prélever le cerveau. En phase aiguë, le porteur indique que les souris peuvent perdre jusqu’à 20 % de leur poids et présenter une forte prostration, l’objet du projet étant de tester des molécules censées rendre les neurones infectés à nouveau détectables par le système immunitaire. Aucun analgésique ni anti-inflammatoire n’est prévu, y compris la buprénorphine, au motif que ces molécules modifieraient les résultats.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Toxoplasma gondii (T. gondii) est un parasite intracellulaire très répandu, auquel environ 1/3 des êtres humains on été exposés. Des réponses immunitaires se développent suite à l’infection mais elles sont incapables d’éliminer le parasite qui persiste ensuite de manière latente dans les muscles, la rétine et le cerveau, sous forme de kystes intra-neuronaux. Plusieurs études suggèrent que des mécanismes d’échappement sont mis en place pour limiter la détection des neurones infectés par les lymphocytes T CD8+, ce qui favorise la persistence à long-terme du parasite dans le cerveau. L’infection chronique par T. gondii est problématique pour la santé car en cas d’immunosuppression, le parasite peut se réactiver et provoquer une encéphalite. De plus, un faisceau d’évidences récentes suggère que cette infection du cerveau, et la neuroinflammation chronique qui l’accompagne, perturbe les fonctions cognitives et accélère le déclin cognitif au cours de la maladie d’Alzheimer. Les traitements disponibles contre T. gondii sont efficaces contre la forme réplicative responsable de la dissémination au cours de l’infection aigue. Cependant, à ce jour, il n’existe aucun traitement capable d’éliminer les formes enkystées, responsables de la chronicité de l’infection. Ainsi, ce projet vise à : (i) mieux comprendre les mécanismes moléculaires permettant à T. gondii d’échapper à la détection par les lymphocytes T CD8+ ; (ii) tester des molécules thérapeutiques pour lever les mécanismes d’échappement afin d’accentuer la détectabilité des neurones infectés par T. gondii vis-à-vis des lymphocytes T CD8+ dans le cerveau et d’aboutir à une élimination (clairance) du parasite.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet vise à comprendre (i) comment les formes persistantes de T. gondii dans les neurones interfèrent avec les neurones infectés pour limiter leur reconnaissance par les lymphocytes T CD8+, et (ii) à tester de nouvelles pistes thérapeutiques pour inverser les effets modulateurs du parasite dans le cerveau. Une meilleure compréhension des réservoirs parasitaires qui persistent en phase chronique de la toxoplasmose est essentiel car il n’existe actuellement aucun traitement contre les kystes. Cette forme latente du parasite peut se réactiver et causer une encéphalite potentiellement mortelle. De plus, l’infection latente chez l’immunocompétent est associée à des troubles neuropsychiatriques (e.g. schizophrénie), diverses altérations cognitives et une accélération du déclin cognitif. A terme, nos résultats pourraient identifier une nouvelle voie thérapeutique conduisant à l’élimination du parasite (clairance) en s’appuyant sur l’immunité naturelle des individus infectés et en rendant plus efficace l’action des lymphocytes T CD8+ dans le cerveau. Ce projet pourrait avoir des retombées majeures et bénéfiques sur la prise en charge des personnes à risque de développer une encéphalite (e.g. porteuses du VIH ou subissant un traitement immunosuppresseur) ainsi que des individus touchés par des démences de type Alzheimer.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Selon les procédures, les animaux seront infectés par : (i) injection intra-péritonéale, une fois ou (ii) gavage per os en 1 fois, qui est le mode naturel d’infection avec T. gondii. Ensuite, en phase chronique de l’infection, les animaux seront seront soumis à soit (i) des injections per os 2 fois par jour, à raison de 5 jours par semaine pendant 4 semaines, soit (ii) des injections intra-péritonéales à raison de 2 fois par semaine, pendant 4 semaines. A l’issue de ces procédures, les animaux seront éventuellement soumis à une chirurgie terminale sous anesthésie profonde sans réveil, pour prélèvement du cerveau.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
La phase aigue de l’infection par T. gondii est symptomatique entre J7 et J15 pi (phase aigue) chez la souris. Pendant cette phase, les animaux peuvent perdre jusqu’à 20% de leur poids initial et présenter une forte prostration. Après récupération suit la phase chronique qui, dans les modèles d’infection latente que nous utilisons, est cliniquement asymptomatique (à l’exception de déficits mnésiques). Les symptomes d’ataxie/syndrome vestibulaire (tête ‘désaxée’, mouvements circulaires récurrents, ataxie) ne sont observés que dans les conditions ‘encéphalite’, rarement en condition latence. Dans les différentes conditions expérimentales que nous projetons de tester, nous nous attendons à observer un meilleur controle, voire une élimination, du parasite lors de la phase chronique, donc nous nous attendons à une moindre nuisance par rapport à l’infection controle. Enfin, les souris subiront des injections intrapéritonéales (i.p.) et des gavages (per os). Ces manipulations peuvent potentiellement induire un stress, une angoisse ou un inconfort et/ou une douleur de faible intensité et transitoire (secondes).
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux dans chaque procédure expérimentale seront euthanasiés en fin d’étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses ex vivo ou in vitro.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Notre projet se focalise sur les interactions entre le parasite Toxoplasma gondii et des cellules du système nerveux (neurones) et immunitaire (lymphocytes T CD8+), qui assurent la surveillance du parasite dans le cerveau. Au lieu d’être propagé in vivo dans des souris comme c’était le cas auparavant, nous cultivons maintenant les tachyzoïtes sur des fibroblastes humains, ce qui contribue à l’objectif de remplacement. En outre, nous avons dédié une partie du projet (cf procédure 1 sans réveil) à l’étude de ces phénomènes in vitro grâce à des cultures de neurones primaires, ce qui limite le nombre d’animaux infectés passant en procédure sévère. Ces expériences in vitro permettent d’étudier les mécanismes moléculaires de l’échappement immunitaire par les neurones infectés mais elles ne suffisent pas pour appréhender les conséquences réelles sur la physiopathologie de la toxoplasmose, ni la pertinence des traitements envisagés. Des infections expérimentales in vivo sont indispensables pour compléter ce projet car la complexité des systèmes immunitaire et nerveux, et du tissu cérébral, autant dans sa composition cellulaire que son architecture, fait qu’il est impossible de simuler (sous forme de modélisation informatique ou d’expériences in vitro) la ‘connectique’ de toutes les populations cellulaires mises en jeu. Par conséquent, il n’est actuellement pas possible de répondre aux objectifs proposés dans ce projet par des méthodes excluant totalement l’utilisation du modèle animal.
2. Réduction
Le nombre d’animaux est calculé a priori en respectant les critères pour une analyse statistique appropriée (cf détails ci-dessous). Les rongeurs utilisés sont consanguins, de mêmes âge et sexe, réduisant la variabilité entre les animaux et donc le nombre nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Basé sur nos précédentes études portant sur des modèles animaux similaires et sur la variabilité inter-individuelle, des lots de 8 animaux (groupes-tests vs. contrôles) sont nécessaires pour assurer la fiabilité de nos résultats, chaque expérience devant être répétée 3 fois. Le nombre d’animaux prévus correspond au nombre minimal permettant une interprétation sans ambiguïté des résultats. Ceci garantira la valeur statistique de l’étude en intégrant les variations inter-expérimentales et les variations inter-individus.
3. Raffinement
Le bien-être de l’animal est un facteur de variabilité expérimentale. Nous prenons ceci en compte grâce au suivi rapproché quotidien des animaux par le personnel de la zootechnie qui évaluera leur état général (toilettage, mouvements), s’assurera de l’enrichissement de leur environnement et du respect de l’aspect social du groupe (pas d’isolement ni de changement de cage). Lors des phases plus sévères (phase aigue de l’infection), l’expérimentateur vérifiera le poids et apportera une aide à l’alimentation quotidiennement (ajout dans la cage d’aliment et d’eau sous forme de gelée (gel-diet et water-gel)). Il/elle évaluera aussi l’état de santé globale des animaux (comportement, prostration, plaies). L’expérimentation sera arrêtée en cas de dégradation de la santé d’un animal atteignant les points limites d’arrêt de la procédure définis plus haut. Le projet ne prévoit pas l’utilisation d’analgésiques ou anti-inflammatoires, car ces molécules sont connues pour interférer avec les processus inflammatoires et pourraient donc modifier les résultats de notre expérimentation. Même les anti-douleurs de type morphinique (buprénorphine) ont des propriétés immunomodulatrices.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
T. gondii peut infecter tout animal homéotherme mais les rongeurs sont des hôtes naturels du parasite. Compte tenu des nombreux outils qui existent chez la souris, cette espèce est pertinente pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires des interactions entre l’hôte et Toxoplasma gondii. De plus, la physiopathologie de la toxoplasmose chronique chez la souris reproduit plusieurs caractéristiques retrouvées chez l’être humain : rôle protecteur de l’immunité cellulaire médiée par les lymphocytes T, kystes persistant dans le cerveau, phénomène d’encéphalite en cas d’immunosuppression, modifications comportementales.