Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 2024-08-29 00:00:00
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-908763)
Applications répétées de molécules irritantes sur la peau, blessures cutanées, inoculations virales, gavages, injections intrapéritonéales et chirurgies de trente minutes : 3 579 souris vont être utilisées, dont 3 425 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Neuf protocoles s’étalent sur huit semaines, certains animaux étant anesthésiés à l’isoflurane jusqu’à cinq fois par semaine. Le porteur écrit que les souris génétiquement modifiées utilisées ici le sont « sans nuisances », leur principale modification étant une sensibilité à la douleur diminuée, et attribue les seules nuisances aux modèles d’inflammation. Toutes sont tuées à la fin, peau, ganglions nerveux, cerveau, moelle épinière, rate et ganglions lymphatiques étant prélevés.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Note de l'OXA. Cette question est celle du formulaire européen de résumé non technique. Elle est posée au laboratoire qui demande l'autorisation, et sa réponse est écrite avant que la première procédure commence (arrêté du 1er février 2013, art. 5). Ces objectifs servent à justifier l'utilisation des animaux devant le comité d'éthique. Aucun document public ne dira ensuite s'ils ont été atteints : la directive permet aux États de faire mettre à jour le résumé avec les résultats de l'appréciation rétrospective (directive 2010/63/UE, art. 43), la base européenne prévoit de les recevoir, et aucune entrée française n'en porte (base ALURES).
En réponse à une coupure, une dermatite ou une infection virale, le système immunitaire déclenche une réponse inflammatoire locale impliquant le recrutement de cellules immunitaires. Cette action du système immunitaire protège des infections, mais peut aussi promouvoir la réparation et la cicatrisation. La peau, barrière de protection et tissu de contact avec l’environnement externe, est aussi innervée de capteurs sensoriels. Ces neurones sensoriels sont localisés dans les ganglions nerveux spinaux (DRG), près de la colonne vertébrale. Ils disposent de longs axones qui s’étendent jusqu’à la peau ce qui leur permet de détecter des stimulations telles que la chaleur, le froid, le toucher. Ils envoient ensuite cette information par signal électrique jusqu’au cerveau, pour déclencher des sensations variées, du plaisir à la douleur. Les neurones sensoriels sont très hétérogènes, et c’est leur diversité qui permet de détecter différentes stimulations pour déclencher des sensations distinctes. En cas d’inflammation ou de blessure de la peau, ces neurones sont activés et peuvent déclencher douleurs, inconfort ou démangeaisons, et ils participent à la défense et à la réparation de l’organisme. En revanche, on ne sait pas encore quel est le rôle précis des différents types de neurones dans ces interactions complexes. De plus, les parties du cerveau activées par ces neurones dans ces situations ne sont pas connues. Le but de ce projet est de déterminer le rôle des différents sous types de neurones sensoriels dans le cadre d’une inflammation de la peau.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Note de l'OXA. Le formulaire européen demande les bénéfices « susceptibles de découler » du projet. Il appelle donc une projection, et il l'obtient : ce que le laboratoire écrit ici est ce qu'il espère, avant d'avoir commencé. Deux chercheuses ont repris six corpus d'études précliniques déjà menées et pesé les dommages réellement infligés aux animaux contre les bénéfices cliniques réellement obtenus : moins de 7 % de ces études ressortaient défendables (Pound et Nicol, 2018).
L’inflammation en général, et les douleurs chroniques associées à l’inflammation (hypersensibilité, démangeaisons), sont encore imparfaitement comprises, et les traitements sont à la fois peu nombreux et comportent des risques de dépendance (ex : opioïdes). Ce projet vise à identifier les neurones sensoriels impliqués dans les douleurs associées à l’inflammation. Un des avantages majeurs de la neuro-immunologie est d’identifier des possibilités de traitements qui pourraient simultanément soigner la pathologie, et limiter les douleurs qui y sont associées. Par ailleurs, notre approche permet de cibler les neurones sensoriels de manière plus précise que ce qui a été fait par le passé, pour mieux comprendre comment sont générées les sensations, mais également dans l’optique de développer des thérapies plus précises en cas de dysfonctionnements. Enfin, les parties du cerveau qui traduisent les diverses stimulations en sensations sont encore mal connues, et notre approche apportera des éléments nouveaux dans ce domaine.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Note de l'OXA. La formule « en règle générale » autorise une réponse générale, et c'est l'un des points sur lesquels les examens de qualité trouvent ces documents défaillants. Cruelty Free International a établi en 2018 que les résumés allemands et britanniques, les seuls examinés à ce jour, décrivaient mal ce qui est fait aux animaux et ce que ceux-ci pourraient éprouver (Taylor et al., 2018). L'adoption d'un modèle commun européen a nettement amélioré le premier point, à peine le second (Taylor et al., 2024).
Les animaux seront soumis à des modèles d’inflammation cutanée, avec réponse immunitaires localisées, qui seront suivis pendant une à trois semaines sur ces souris. Plusieurs injections seront réalisées sur les souris, selon les règles éthiques en vigueur. Des injections intrapéritonéales et sous cutanées se feront sur souris immobilisées en vigiles et prennent une dizaine de seconde par animal. Des gavages oraux sont aussi réalisés sur certaines souris immobilisées et prennent jusquà 20 secondes par animal. Les injections intrapéritonéales et les gavages sont espacés d’au moins deux jours. L’application cutanée de molécule irritantes, ou la création d’une blessure cutanée, se feront sous anesthésie et prennent jusqu’à une minute par souris. Un prélèvement sanguin pourra être réalisé sur certains animaux immobilisés en vigiles, et prennent jusqu’à une minute par animal. Certaines procédures nécessiteront une chirurgie sous anesthésie, après laquelle la plaie sera suturée, et la souris traitée avec un antalgique immédiatement après et surveillée quotidiennement pour s’assurer de son rétablissement. Le temps estimé pour ces procédures chirugicales est estimé à 30 minute par animal, à la suite de quoi l’animal est maintenu sous surveillance jusqu’à son réveil. La procédure 2 requiert 1 injection intrapéritonéale, trois gavages, un prélèvement sanguin, et 7 applications cutanée d’une molécule inflammatoire, sur une durée de 8 semaines. La procédure 3 requiert 1 injection intrapéritonéale, trois gavages, un prélèvement sanguin, et 7 applications cutanée d’une molécule inflammatoire, sur une durée de 8 semaines. La procédure 4 requiert 6 injections intrapéritonéales, trois gavages, un prélèvement sanguin, et une blessure cutanée, sur une durée de 8 semaines. La procédure 5 requiert 5 injections intrapéritonéales, trois gavages, un prélèvement sanguin, et une inoculation virale cutanée, sur une durée de 8 semaines. La procédure 6 requiert une inoculation virale cutanée, 5 injections intrapéritonéales, et trois gavages, sur une durée de 8 semaines. La procédure 7 requiert une procédure chirugicale, et 4 injections sour-cutanée, sur une semaine. La procédure 8 requiert 2 injections péritonéales, 3 gavages, une injection sous cutanée, et une intervention chirurgicale, sur une période de 8 semaines. La procédure 9 requiert une injection sous cutanée, une injection intrapéritonéale, et une intervention chirurgicale, sur une période de 3 semaines.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Note de l'OXA. C'est l'endroit du document où les animaux devraient apparaître, et c'est celui qui résiste. Cruelty Free Europe a mesuré en 2024 que cinq des six éléments attendus sur les dommages prévus progressaient depuis l'adoption d'un modèle commun européen. Les effets indésirables sont le sixième : 41 % des résumés allemands et 48 % des britanniques les décrivent complètement. Les auteurs relèvent aussi des effets présentés comme minimes sur des projets classés modérés ou sévères (Taylor et al., 2024). Ces deux pays sont les seuls dont les résumés ont été examinés. Les résumés français relèvent du même modèle européen, et leur qualité n'a jamais été mesurée.
Nous utiliserons des modèles de souris génétiquement modifiées sans nuisances pour les animaux. L’effet principal des modifications génétiques que nous réalisons est une diminution de la sensibilité à la douleur chez ces animaux (sensibilité à la chaleur, ou aux stimulations mécaniques). On utilise également un modèle génétique pour activer les neurones sensoriels impliqués dans les sensations de plaisir. En revanche, ce sont les modèles d’inflammation utilisés qui peuvent causer des nuisances chez les animaux, avec le développement de réactions immunitaires sur une zone définie de la peau. Par ailleurs, le suivi de certaines souris impliquera une anesthésie légère à l’isoflurane jusqu’à 5 fois par semaine, ce qui pourra induire du stress à l’animal. Enfin, certaines méthodes d’étude du cerveau nécessiteront des chirurgies sous anesthésie, pour lesquelles un traitement post-opératoire et un suivi rigoureux sont nécessaires pour s’assurer du bon rétablissement de l’animal et limiter les conséquences post-opératoires.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Note de l'OXA. Le formulaire demande de justifier ce sort, non de le décrire. L'analyse dommage-avantage que la directive impose au comité d'éthique porte sur « la souffrance, la douleur et l'angoisse » infligées aux animaux (directive 2010/63/UE, art. 38). Quand ce sort est la mise à mort, celle-ci ne figure donc pas parmi les dommages que le comité met en balance avec les bénéfices annoncés. L'OXA écrit « mise à mort » plutôt que « sacrifice », qui emprunte au registre du don consenti, ou « euthanasie », qui désigne une mort décidée dans l'intérêt de celui qui meurt.
L’ensemble des animaux utilisés sera euthanasié à l’issue de la procédure. Les organes d’intérêts (peau, DRG, cerveau, moelle épinière, rate, ganglion lymphatique) pourront alors être prélevés pour des études d’histologie, d’ARN, ou de cytométrie en flux.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Note de l'OXA. La directive demande au résumé « une démonstration de la conformité » aux exigences de remplacement, de réduction et de raffinement (directive 2010/63/UE, art. 43). C'est donc le demandeur qui démontre sa propre conformité, dans le document même qui sollicite l'autorisation. Cette démonstration peut prendre la forme d'une affirmation qu'aucune méthode de substitution n'existe, que le document n'a pas à sourcer. Ces trois exigences sont par ailleurs subordonnées à l'objectif du projet : elles cherchent à remplacer les animaux dans un projet donné, elles n'interrogent pas ce projet.
Les interactions entre neurones et cellules immunitaires sont complexes et impliquent de nombreuses interactions, pour laquelle l’étude d’organismes entiers est requise. Les neurones sensoriels ne peuvent pas être étudiés sur des biopsies de patients humains (sauf post-mortem), et il n’y a pas encore les connaissances disponibles pour produire in vitro des cultures de neurones proches de ceux qui existent dans l’organisme. Seuls les modèles animaux permettent d’étudier ces neurones de manière rigoureuse et fiable. Nous utilisons également plusieurs approches ex vivo dans ce projet, qui ne sont pas décrites dans cette demande pour prélever et étudier les neurones et cellules immunitaires dans des cultures en boite de pétri (ex : culture des neurones sensoriels). Cette méthode est notamment utile pour observer des mécanismes moléculaires spécifiques .
2. Réduction
Note de l'OXA. La réduction dont il est question ici porte sur le nombre d'animaux par groupe expérimental, calculé pour que l'analyse statistique tienne. Le total annoncé dans la fiche est une estimation portant sur une autorisation de cinq ans au maximum (code rural, art. R214-123) : il ne dit pas combien d'animaux seront effectivement utilisés, et il ne se rapporte pas à une année.
Le plan de nos expériences est construit de sorte à limiter le nombre de souris. Nous avons mené une étude statistique pour pouvoir déterminer les nombres d’animaux minimum pour répondre à chaque question scientifique posée. Après la mise à mort, un maximum d’organes seront prélevés afin d’obtenir le plus d’information possible pour chaque souris, et afin d’éviter d’avoir à répéter inutilement des expériences. Enfin, nous utiliserons des souris particulières, dites « congéniques », permettant de limiter la variabilité d’un individu à l’autre , et ce qui permet d’utiliser un nombre réduit de souris pour chaque expérience.
3. Raffinement
Note de l'OXA. Le raffinement nomme une amélioration technique de la procédure, sans dire ce qu'elle change pour l'animal qui la subit. La réglementation impose d'atténuer la douleur, dans une limite qu'elle inscrit elle-même : « pour autant que cela soit compatible avec la finalité de la procédure expérimentale » (code rural, art. R214-109). Ce qui reste de souffrance après cette limite est autorisé. Le raffinement ne porte par ailleurs que sur la procédure : les souffrances de la captivité elle-même, confinement, bruit, lumière, manipulations d'entretien, ne relèvent d'aucun des trois R.
Pour réduire le stress des animaux, un temps d’acclimatation d’au minimum une semaine sera respecté après un transfert d’une animalerie à l’autre ainsi qu’avant toute procédure expérimentale. Les souris seront hébergées en cage standard avec toit filtrant au nombre de 5 souris par cage, avec de la sciure de bois utilisée comme litière, des lanières de papier kraft comme matériau de nidification et des maisons en dôme. Les souris sont nourries et sont libres de leurs déplacements. Les souris génétiquement modifiées utilisées ne présentent pas de phénotype dommageable. Certaines procédures nécessitant une chirurgie sur les souris, suivront un protocole strict visant à réduire la souffrance de l’animal pendant et après la chirurgie (traitements pré et post-opératoires). Les souris seront maintenues profondément anesthésiées lors de l’opération puis traitées avec des analgésiques (et anti-inflammatoires si nécessaire). Si les animaux montrent des signes de souffrance, des doses supplémentaires d’analgésiques seront fournies. Dans le cas où ces signes perdurent, les animaux seront mis à mort. Une surveillance quotidienne est réalisée lorsque la souris a subi une intervention, pour surveiller notamment son poids, son comportement, et la zone d’inflammation. Si l’animal a un état général qui se dégrade à cause de la procédure, il sera mis à mort et l’expérience arrêtée. De la nourriture humide sera déposée systématiquement dans la cage des animaux pendant 2 jours suivant l’infection pour faciliter au maximum l’alimentation.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Note de l'OXA. Le dossier d'autorisation demande de justifier l'origine des animaux, leur espèce, leur nombre estimé et leur stade de développement (arrêté du 1er février 2013, art. 5). La justification attendue est technique : elle porte sur l'adéquation de l'espèce à l'objectif poursuivi. Ce que l'appartenance à une espèce autorise à faire subir à un individu est une question morale, et le formulaire ne la pose pas. L'appartenance à une espèce, prise seule, ne fonde pourtant pas de différence de statut moral entre des individus également capables de souffrir.
La souris constitue un modèle idéal pour notre étude. Le haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme (dans notre cas, les schémas des systèmes immunitaires et neuronaux sont très similaires entre l’homme et la souris), l’état actuel des connaissances, les outils et structures disponibles pour sa manipulation et un temps de génération court font de la souris le modèle idéal à l’étude des systèmes immunitaire et nerveux. De plus, le modèle murin est un modèle de choix par l’existence de souris génétiquement modifiées.