Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 06/11/2024
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-866254)
Un morceau de crâne remplacé par une fine lame de verre laissée en place jusqu’à la mort de l’animal, puis huit points d’observation en microscopie après une injection unique: 60 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées au terme du suivi ou dès l’atteinte d’un point limite. Chaque souris reçoit d’abord une greffe de cellules de glioblastome dans le cerveau, puis, trois semaines plus tard, une seconde chirurgie pour retirer la tumeur, avec jusqu’à cinq séances d’imagerie par bioluminescence entretemps et une injection intrapéritonéale de luciférine avant chacune. Le projet vise à décrire la cicatrisation cérébrale après exérèse et la distribution de cinq molécules fluorescentes, le porteur relevant que la plupart des études in vivo omettent cette chirurgie pourtant systématique chez les patients. Les souris utilisées sont nues et immunodéficientes, ce qui évite le rejet des cellules tumorales humaines greffées, et elles sont hébergées seules après la pose de la fenêtre crânienne.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La chirurgie correspond au premier traitement des patients atteints de tumeurs cérébrales, même si elle est le plus souvent imparfaite et laisse systématiquement quelques cellules tumorales qui doivent être traitées par des thérapies complémentaires (radiothérapie et chimiothérapie). Etrangement, la plupart des études in vivo chez l’animal n’incluent pas cette chirurgie. Ainsi, les conséquences de l’opération, telles que la cicatrisation du tissu cérébral après l’opération, sont mal connues et rarement prises en compte chez l’animal. Or, la chirurgie impacte forcément l’efficacité des traitements complémentaires (tels que les chimiothérapies) délivrés par voie intraveineuse après l’opération. Pour les recherches qui tentent de développer des thérapies innovantes incluant des agents de chimiothérapie, il paraît pertinent et nécessaire de mieux prendre en considération la situation post-opératoire. C’est pourquoi dans ce projet, nous proposons d’étudier par microscopie de fluorescence les modifications du tissu cérébral survenant après l’extraction de la tumeur et leurs conséquences. Notamment, nous souhaitons : 1-étudier la structure et la perméabilité des vaisseaux sanguins cérébraux lors de la « cicatrisation » après chirurgie ; 2-étudier la reprise/recroissance de la tumeur à partir des cellules tumorales laissées après chirurgie ; 3-évaluer l’impact sur la distribution intracérébrale de molécules fluorescentes administrées par voie intraveineuse. Nous prévoyons de travailler avec 5 molécules fluorescentes de taille variable qui seront administrées par voie intraveineuse et nous comparerons comment elles se répartissent dans les vaisseaux sanguins cérébraux, dans les cellules tumorales restantes et dans le cerveau sain. Les méthodes mises en œuvre dans ce projet et utilisées dans des projets précédents, sont parfaitement maitrisées. Le projet se déroulera sur 2 établissements distincts (Etablissement Utilisateur 1 : hébergement, chirurgies, injection d’agents fluorescents, imagerie de fluorescence, ; Etablissement Utilisateur 2 : imagerie par production et émission de lumière)
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
L’efficacité des thérapies anticancéreuses (agents de chimiothérapie, thérapies ciblées, …) administrées par voie orale ou intraveineuse, est directement dépendante de la quantité d’agent thérapeutique capable d’atteindre les cellules tumorales dans le cerveau. La chirurgie, qui vise à ôter la tumeur, n’est jamais complète et laisse toujours quelques cellules tumorales à l’origine d’une reprise de la tumeur. Ce sont ces cellules « restantes » que ciblent les chimiothérapies complémentaires : il faut donc que les médicaments injectés par voie intraveineuse soient capables de les atteindre pour les détruire. Dans ce contexte, ce projet permettra de mieux comprendre la « cicatrisation » post-opératoire, et de décrire la distribution des agents de chimiothérapie, administrés après chirurgie, en fonction de leur taille. Ces éléments de connaissance sont indispensables pour nos travaux futurs qui visent à développer et optimiser de nouvelles thérapies pour les tumeurs cérébrales: ces données ouvriront des pistes de réflexion et fourniront des arguments solides concernant le « meilleur timing » pour l’administration de substances actives après chirurgie.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Pour chaque souris, nous réaliserons une greffe de tumeur par injection de cellules tumorales dans le cerveau (1ère chirurgie d’environ 30 minutes) puis environ 3 semaines après, la tumeur formée sera ôtée par chirurgie (2ème chirurgie d’environ 30 minutes). La deuxième chirurgie nécessite d’ôter une partie de l’os du crâne (= appelée volet osseux pour permettre d’accéder à la tumeur) et en fin de chirurgie, l’os manquant sera remplacé par une lame de verre très fine pour permettre les observations du cerveau en microscopie de fluorescence. La fenêtre en verre restera positionnée jusqu’à la mise à mort des animaux. Les animaux feront l’objet de plusieurs analyses en imagerie : entre la 1ère et la 2ème chirurgie, des imageries basées sur la lumière émise par les cellules tumorales appelée bioluminescence (environ 10 minutes, répétées maximum 5 fois sur 3 semaines) nécessiteront l’injection intrapéritonéale d’un produit de contraste (appelé luciférine) avant chaque acquisition ; après la 2ème chirurgie, des molécules fluorescentes seront injectées par voie intraveineuses (1 injection 1 fois) et un suivi par microscopie sera réalisé à différents temps (avant injection, 5 min, 1h, 4h, 24h, 48h, 72h et 168h après injection puis 1 à 2 fois / semaine pour une partie des animaux)
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
La première nuisance attendue correspond au développement d’une tumeur cérébrale qui peut induire des symptômes cliniques. Mais, l’expérience montre que l’intervention chirurgicale suffisamment anticipée (environ 3 semaines après la greffe de cellules tumorales) permet de lever ces symptômes. Les chirurgies et l’imagerie par émission de lumière (bioluminescence) se feront sous anesthésie chimique. Nous privilégierons l’anesthésie gazeuse lors des imageries en microscopie de fluorescence. L’imagerie par bioluminescence nécessite un transport des animaux dont les conditions ont été optimisées lors de projets précédents afin de réduire l’inconfort et le stress des souris. Le cycle jour/nuit de l’animalerie étant inversé, la gêne occasionnée par les expérimentations diurnes sera faible, les animaux étant ainsi manipulés durant leur phase d’activité. Les injections en intraveineuse, effectuées dans la veine de la queue à l’aide d’aiguilles très fines, sont parfaitement maitrisées, ce qui permet d’éviter les risques d’extravasation notamment lors des injections d’agent anticancéreux.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
La fin de l’expérimentation correspond soit à un temps de prélèvement des échantillons, soit à l’atteinte d’un point limite, ce qui se traduit par la mise à mort pour tous les animaux.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est dans ce contexte pas possible puisque la chirurgie des tumeurs cérébrales et l’analyse de ses conséquences, notamment sur le devenir d’agents thérapeutiques, ne peuvent être étudiées qu’in vivo sur un modèle animal.
2. Réduction
Grâce au suivi par imagerie, nous sommes en mesure d’évaluer les événements au cours du temps. A ce stade, nous ne pouvons pas prédire si des différences faibles, modérées, ou fortes entre les différents lots et/ou au cours du temps seront observées. C’est pourquoi, nous prévoyons un maximum de 10 animaux / lot mais les expérimentations seront conduites par palier. Ainsi, pour l’étape 1, une appréciation intermédiaire des effets au bout de 4 animaux par lot (étape 1a) permettra d’ajuster la démarche en poursuivant uniquement pour les lots/les temps d’analyses/les paramètres les plus pertinents (étape 1b) selon un principe go/no go (« go » si une différence perçue doit être confirmée / « no go » si on ne constate aucune différence ou si une différence très évidente apparaît). L’étape 2 comparant la biodistribution et les effets des formes libre ou encapsulée d’agent anticancéreux ne sera conduite que si elle reste pertinente au regard des résultats de l’étape 1. Parmi les différents paramètres (longueur et ramification du réseau vasculaire, intensité de fluorescence proportion de surface fluorescente, etc…) obtenus à partir des analyses d’images de fluorescence acquises au cours du temps, ceux qui paraitront les plus pertinents feront l’objet d’une comparaison statistique.
3. Raffinement
Une attention toute particulière sera portée aux animaux, pendant l’hébergement, au moment des chirurgies et des imageries, et lors du transport entre les 2 établissements utilisateurs. Hébergement à 5 souris / cage jusqu’à la pose de la fenêtre crânienne puis hébergement individuel pour garantir le bien-être optimal des souris ; température et hygrométrie contrôlées, eau et nourriture ad libitum, enrichissement sous forme de sopalin et de bâtonnets en bois à ronger. Pour prévenir la douleur liée aux interventions chirurgicales et au stress engendré par la contention, les animaux seront anesthésiés. Chirurgies : anesthésie locale et analgésie pré-, per-, et post-opératoire. Protection des yeux par du gel ophtalmique. Température de l’animal maintenue par tapis chauffant. Micro-saignements stoppés à l’aide de cotons hémostatiques. Au réveil : Maintien au chaud dans une cage propre ; administration d’eau sucrée et accès à quelques croquettes humidifiées placées directement dans la cage pour faciliter la réhydratation et la récupération. Après chirurgie : nettoyage quotidien de la zone incisée. Observation quotidienne du comportement naturel et face à l’expérimentateur pour évaluer la douleur et le stress ; mesure quotidienne du poids ; alimentation, hydratation, motricité et coordination. Quel que soit le groupe, la mise à mort sera pratiquée dès atteinte des points limites définis (perte de poids et problème de motricité essentiellement). Transport : à pied entre les 2 établissements d’expérimentation dans une cage à couvercle filtrant. Les cages seront placées dans un sac isotherme pour les isoler de l’environnement extérieur, et selon la température extérieure, des ‘bouillottes’ préalablement chauffées pourront être disposées sous la cage pour éviter des variations de température liées aux conditions climatiques.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Dans les études menées en oncologie, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles murins (souris et rats). Les souris constituent l’espèce de référence compte tenu de leur accessibiltié et de leur facilité de manipulation. Les souris nue sont classiquement utilisées dans le cas de greffes de cellules tumorales humaines : du fait de leur immunodéficience il n’y a ainsi pas de rejet du greffon tumoral implanté. Nous utiliserons des souris femelles et mâles, puisque les paramètres à étudier sont a priori indépendants du sexe.