Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 21/01/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-717811)
Une injection de 200 tachyzoïtes de Toxoplasma gondii dans l’abdomen, une incision de la veine de la queue au scalpel, puis jusqu’à quarante administrations orales ou dix injections intrapéritonéales étalées sur un mois. 1 392 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l’issue pour prélèvement d’organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 528 d’entre elles et sévère pour 864. Entre le septième et le quinzième jour, elles peuvent perdre jusqu’à 20 % de leur poids et présenter une forte prostration, et certaines passent jusqu’à trois semaines isolées en cage individuelle pour le labyrinthe de Barnes, sans qu’aucun analgésique soit prévu, au motif qu’il interférerait avec l’inflammation étudiée. Les retombées annoncées se limitent à de possibles pistes pour la prise en charge des troubles cognitifs liés au parasite, formulées au conditionnel.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’inflammation du cerveau, ou ‘neuroinflammation’, peut perturber le fonctionnement des neurones. La neuroinflammation peut apparaître au cours du vieillissement naturel ou lors de pathologies associées au vieillissement telles que la maladie d’Alzheimer (MA). Cette neuroinflammation peut aussi être causée par des infections du cerveau, telles que celle causée par le parasite Toxoplasma gondii (T. gondii). Parmi les cellules immunitaires s’accumulant dans le cerveau au cours de la neuroinflammation, on trouve une catégorie de lymphocytes T appelés résidents mémoire. Les lymphocytes T résidents mémoire du cerveau participent à la surveillance immunitaire contre les agents infectieux (e.g. T. gondii), mais ils pourraient aussi jouer un rôle néfaste. En effet, ces cellules sont impliquées dans des maladies inflammatoires et / ou dégénératives du cerveau, telles que la sclérose en plaques et la MA. A l’aide d’un modèle murin de MA, nous avons observé que l’infection chronique par T. gondii précipite le déclin cognitif et s’accompagne d’une accumulation de lymphocytes T résidents mémoire dans l’hippocampe, une zone cérébrale impliquée dans la mémorisation. Même au cours du vieillissement naturel, les lymphocytes T résidents mémoire peuvent s’accumuler dans le cerveau, suggérant une possible contribution de ces cellules dans le déclin mnésique naturel lié à l’âge. Les mécanismes effecteurs par lesquels les lymphocytes T résidents mémoire altèrent les fonctions cognitives restent non élucidés. Notre projet vise à étudier la contribution de ces sous-populations de lymphocytes et de leurs mécanismes d’action, dans le déclin cognitif naturel associé au vieillissement naturel et au vieillissement accéléré (MA) par l’infection par T. gondii.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
T. gondii est un parasite intracellulaire très répandu, auquel environ 1/3 des humains ont été exposés. Des réponses immunitaires se développent suite à l’infection mais elles ne permettent pas d’éliminer le parasite, qui persiste ensuite de manière latente dans les muscles, la rétine et le cerveau, sous forme de kystes intra-neuronaux contenant des bradyzoïtes. Parmi les 2 milliards d’êtres humains exposés à T. gondii, il est estimé que ~2/3 sont porteurs de kystes parasitaires cérébraux. A ce jour, ces kystes ne peuvent pas être éliminés pharmacologiquement. Ainsi, un grand nombre d’individus immunodéprimés (e.g. porteurs du VIH ou subissant un traitement immunosuppresseur) sont à risque de développer une encéphalite, et les individus immunocompétents infectés sont à risque de développer des troubles cognitifs et/ou de subir une accélération du cours de la MA. Les résultats de ce projet pourraient suggérer de nouvelles pistes pour améliorer la prise en charge des troubles neurocognitifs associés à l’infection par T. gondii.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Animaux âgés traités avec des des inhibiteurs de perforine ou granzyme B (traitement anti-cytotoxicité) : – 10 injections intra-péritonéales (pendant 5 sec) tous les 3 jours pendant 1 mois. – ou bien 3 injections intra-veineuses dans la veine caudale à 2 semaines d’intervalle (pendant 10 sec) // Animaux infectés traités avec des inhibiteurs de perforine ou granzyme B (traitement anti-cytotoxicité) dans les modèles de MA : – 1 injection intra-péritonéale de 200 tachyzoïtes (5 sec) puis prélèvement de sang, obtenu via une légère incision à la veine caudale réalisée avec une lame de scalpel, une fois (après application de crème anesthésiante), puis – soit 10 injections intra-péritonéales à raison d’une injection de 5 sec tous les 3 jours pendant 1 mois ; – soit 3 injections intra-veineuses de 10 sec dans la veine caudale à 2 semaines d’intervalle // Animaux infectés traités avec des inhibiteurs du complexe PRC (traitement anti-kystes) dans les modèles de MA : – 1 injection intra-péritonéale de 200 tachyzoïtes (5 sec) puis prélèvement de sang, obtenu via une légère incision à la veine caudale réalisée avec une lame de scalpel une fois (après application de crème anesthésiante) puis – soit 40 injections per os (en 10 sec), à raison de 2 aministrations par jour, 5 jours par semaine pendant 4 semaines ; – soit 8 injections intra-péritonéales de 5 sec, à raison de 2 fois par semaine pendant 4 semaines. // Tests comportementaux effectués 1 x selon le chronogramme suivant : J1 : Labyrinthe en croix surélevé sur 10 min, J2 : Test de localisation d’objet sur 10 min, J3 : Test de reconnaissance de nouvel objet sur 10 min, J4 : Placement en cage individuelle, J9-J14 : essais d’apprentissage au labyrinthe de Barnes (3 ou 4 essais / jour pendant 5 jours), J15 et J17 : tests de rappel de mémoire à 24h et 72h post-apprentissage, J17 : remise des souris en groupe, J20 : euthanasie pour analyses ex vivo
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
La phase aigue de l’infection par T. gondii est symptomatique entre J7 et J15 (phase aigue) chez la souris. Pendant cette phase, les animaux peuvent perdre jusqu’à 20% de leur poids initial et présenter une forte prostration. Ensuite, les souris récupèrent et entrent en phase chronique qui, dans les modèles d’infection latente que nous utilisons, est cliniquement asymptomatique (à l’exception de déficits mnésiques). Les symptomes d’ataxie/syndrome vestibulaire (i.e. tête ‘désaxée’, mouvements circulaires récurrents) ne sont observés que dans des modèles d’encéphalite toxoplasmique, pas dans notre modèle d’infection latente. Les traitements inhibiteurs de la cytotoxicité pouvant altérer la surveillance immunitaire du parasite dans le cerveau, il est possible que nous observions une dégradation de l’état général des souris, causée par une réactivation du parasite, suite à l’administration de ces inhibiteurs. Dans ce cas, nous prendrons les décisions sur la base du tableau de scoring, tel que définies dans la procédure. Les souris subiront des injections intrapéritonéales (ip) ou intra-veineuses (iv). Ces manipulations sont susceptibles d’induire un stress, une angoisse, un inconfort et/ou une douleur de faible intensité et transitoire (secondes). L’isolement dans une cage individuelle (uniquement pendant la période de mesures sur le labyrinthe du Barnes) pourrait entraîner des changements, imputables au stress, dans la physiologie et le comportement des animaux. Cette période d’isolement sera limitée à 3 semaines maximum, et l’enrichissement des cages sera renforcé pour limiter le stress lié à la privation des aspects sociaux.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux dans chaque procédure expérimentale seront euthanasiés en fin d’étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses ex vivo.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Au lieu d’être propagé in vivo dans des souris comme c’était le cas auparavant, nous cultivons désormais les tachyzoïtes de Toxoplasma gondii sur des fibroblastes humains in vitro, ce qui contribue à l’objectif de remplacement. En revanche, des infections expérimentales in vivo restent indispensables pour appréhender les interactions entre systèmes nerveux (ex. neurones infectés) et immunitaire (ex. lymphocytes T), les mécanismes par lesquels le parasite T. gondii modifie ces interactions, ainsi que la pertinence des traitements envisagés. La complexité des systèmes immunitaire et nerveux, et du tissu cérébral, autant dans sa composition cellulaire que son architecture, font qu’il est à ce jour impossible de simuler (sous forme de modélisation informatique ou d’expériences in vitro) la ‘connectique’ de toutes les populations cellulaires mises en jeu. Par conséquent, il est actuellement impossible de répondre aux objectifs proposés dans ce projet par des méthodes excluant totalement l’utilisation du modèle animal.
2. Réduction
Le nombre d’animaux est calculé a priori en respectant les critères pour une analyse statistique appropriée. Les rongeurs utilisés sont consanguins, de mêmes âge et sexe, réduisant la variabilité entre les animaux et donc le nombre nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Basé sur nos précédentes études portant sur des modèles animaux similaires et sur la variabilité inter-individuelle, des lots de 8 animaux (groupes-tests vs. contrôles) sont nécessaires pour assurer la fiabilité de nos résultats, chaque expérience devant être répétée 3 fois. Le nombre d’animaux prévus correspond au nombre minimal permettant une interprétation sans ambiguïté des résultats. Ceci garantira la valeur statistique de l’étude en intégrant les variations inter-expérimentales et les variations inter-individus.
3. Raffinement
Le bien-être de l’animal est un facteur de variabilité expérimentale. Nous prendrons ceci en compte grâce au suivi rapproché et quotidien des animaux par le personnel de la zootechnie qui évaluera leur état général (toilettage, mouvements), s’assurera de l’enrichissement de leur environnement et du respect de l’aspect social du groupe (isolement limité à 3 semaines au maximum). Lors des phases potentiellement plus sévères, l’expérimentateur.rice vérifiera le poids et apportera quotidiennement une aide à l’alimentation (ajout dans la cage d’aliment et d’eau sous forme de gelée). Il/elle évaluera aussi l’état de santé global des animaux (comportement, prostration, plaies). L’expérimentation sera arrêtée en cas de dégradation trop importante de la santé d’un animal, atteignant un point-limite. Le projet ne prévoit pas l’utilisation d’analgésiques ou anti-inflammatoires stéroïdiens ou non stéroïdiens, car ces molécules sont connues pour interférer avec les cellules et les processus inflammatoires. Même les antalgiques de type morphinique ont des propriétés immunomodulatrices. Ces molécules seraient donc susceptibles de modifier fortement les résultats de notre expérimentation, qui cherche justement à estimer le rôle de la neuroinflammation et des lymphocytes T dans le déclin des fonctions cognitives.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Compte tenu des connaissances accumulées sur le fonctionnement des systèmes nerveux et immunitaire de la souris, et des nombreux outils qui existent dans cette espèce de rongeur, cette espèce est totalement pertinente pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires des interactions entre l’immunité adaptative (par ex. lymphocytes T résidents) et le système nerveux (fonctions cognitives), y compris dans le contexte d’infection parasitaire par Toxoplasma gondii. En effet, alors que Toxoplasma gondii peut infecter tout animal homéotherme, les hotes définitifs du parasite sont les félins, ce qui fait des rongeurs (proies classiques des félins) des hôtes pertinents dans le cycle de vie naturel du parasite. En outre, la physiopathologie de la toxoplasmose chronique chez la souris reproduit les caractéristiques retrouvées chez l’être humain, à savoir : rôle protecteur de l’immunité cellulaire médiée par les lymphocytes T, kystes persistant dans le cerveau, phénomène d’encéphalite en cas d’immunosuppression, modifications comportementales. Des souris adultes agées de 8 à 80 semaines seront utilisées afin d’étudier le rôle des lymphocytes T résidents intra-cérébraux et des mécanismes cytotoxiques, dans le déclin cognitif associé au vieillissement naturel. Pour les infections expérimentales avec T. gondii combinées avec le développement de la maladie d’Alzheimer, nous utiliserons des souris adultes agées de 8 à 11 semaines.