Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 27/03/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-242443)
Les souris dont l’état se dégrade nettement sont tuées immédiatement, puis analysées. 405 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dont 360 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 45 pour l’élevage, mises à mort à un an. Chacune subit un prélèvement de 2 mm au bout de la queue, quatre injections abdominales consécutives, puis deux injections sous la peau et dans l’abdomen d’un mélange qui déclenche une inflammation du système nerveux reproduisant la sclérose en plaques. Le porteur affirme avoir choisi des conditions d’induction produisant des symptômes « modérés », sans douleur ni perte de poids significative, et annonce que les retombées « devraient sans nul doute » ouvrir des pistes thérapeutiques chez l’humain.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La sclérose en plaques (SEP) est une maladie chronique du cerveau et de la moelle épinière qui conduit à une destruction progressive de la gaine de protéines qui entoure les neurones. Elle est dévastatrice et conduit à la paralysie du patient. Une partie des cellules immunitaires, les macrophages du cerveau appelés microglies (MG), protègent normalement le système nerveux central du développement de la SEP. Il a été récemment découvert que les MG contiennent une substance nommée la protéine P, qui contrôle la fonction des MG et leur capacité de protection contre les maladies du cerveau. L’objectif de ce projet est d’étudier in vivo le rôle de la protéine P dans la progression de la SEP chez des souris transgéniques, en induisant la maladie par un traitement chimique. Nous étudierons également comment la protéine P modifie l’activité des MG. Nous espérons que notre projet permettra d’identifier de nouveaux outils diagnostics et thérapeutiques dans le contexte de la SEP.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Le rôle de la protéine P dans un modèle murin de SEP n’a jamais été testé et permettra de confirmer des résultats préliminaires in vitro sur son rôle dans la progression de la SEP. Les données que nous obtiendrons permettront d’identifier de nouveaux outils pronostics, et peut-être thérapeutiques, en découvrant les gènes contrôlés par la protéine P dans les MG, qui seront des cibles thérapeutiques potentielles. Les retombées de ce travail seront utiles pour la compréhension des mécanismes pathologiques de la SEP et devraient sans nul doute faire découvrir de nouveaux outils de prévention et des implications thérapeutiques à terme chez l’homme.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les souris auront une biopsie de la queue, qui consiste à prélever 2 mm de l’extrémité de la queue. Elles recevront pendant quatre jours consécutifs une injection dans le ventre d’un produit permettant de supprimer la protéine P chez les souris ayant une modification génétique spécifique. Cette injection dure moins de deux minutes. Quatorze jours plus tard, les souris recevront deux injections sous la peau et dans le ventre d’une combinaison de substances produisant le modèle de sclérose plaques chez l’animal. Ce traitement consiste à injecter deux produits qui induisent une inflammation du système nerveux. Cette intervention dure moins de 15 minutes sur des souris anesthésiées pour éviter tout stress chez l’animal. Toutes les souris seront observées quotidiennement pour évaluer l’évolution de la pathologie. Celles présentant une dégradation importante de leur état seront immédiatement euthanasiées et analysées.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
La biopsie de l’extrémité de la queue peut causer une brève douleur et un léger saignement qui seront arrêtés par une légère pression exercée localement.Si une rougeur au niveau de la queue est observée nous appliquerons un antiseptique (Clorhexidine). Des injections répétées pendant quatre jours consécutifs peuvent être une source de stress pour les animaux.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les 45 souris utilisées pour l’élevage seront euthanasiées à l’âge d’un an. Les 360 souris étudiées (souris d’intérêt et souris contrôle) seront euthanasiées à la fin de l’étude (10 à 15 semaines pour les souris euthanasiées au pic de la maladie et 12 à 17 semaines pour les souris euthanasiées 30 jours après induction de la maladie). Des études post-mortem seront réalisées sur les cellules immunitaires prélevées dans le cerveau de ces souris.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Toutes les données in vitro montrent clairement, et pour la première fois, que la protéine P est exprimée par les macrophages (MG) du cerveau et contrôle leur fonction. La lignée de souris qui n’exprime plus P dans les MG nous permettra de mimer au mieux la sclérose en plaques, une maladie très sévère qui conduit à la paralysie des patients et à leur mort. Les connaissances issues de cette étude sur l’animal ne peuvent pas être obtenues par d’autres méthodes, étant donné la complexité physiologique du développement de la sclérose en plaques. Nous sommes donc obligés de travailler à l’échelle de l’organisme. L’inactivation de la protéine P ne peut être réalisée que sur l’animal et la complexité du cerveau ainsi que les interactions entre les nombreux types cellulaires impliqués dans la maladie ne peuvent pas être reproduites in vitro par des cultures cellulaires.
2. Réduction
Nous utilisons l’effectif minimal qui permet d’avoir des résultats robustes qui pourront ensuite être transposés chez l’homme. L’induction de la maladie sera réalisée en trois séries d’expériences : 1). – pour suivre l’état clinique des animaux pendant un mois ; 2) – pour isoler les macrophages du cerveau (MG) au pic de la maladie et les analyser ; 3)- pour isoler les macrophages du cerveau des souris avec ou sans la protéine P, en absence de la maladie. Cette dernière étape nous indiquera des marqueurs qui pourront être utilisés pour prédire la progression de la maladie. Le nombre total de souris est de 360. 45 souris seront utilisées comme géniteurs dans l’élevage. Pour réduire le nombre total de croisements et donc de souris, nous utiliserons aussi bien des femelles que des mâles, parce que la maladie SEP ne montre pas de différence due au genre.
3. Raffinement
Les méthodes et les mesures choisies visent à diminuer au maximum les contraintes imposées aux animaux. Les souris sont placées par groupe de cinq dans des cages ventilées. La température, l’humidité, la nourriture et l’eau sont contrôlées tous les jours. En plus de la litière, les cages sont enrichies avec un bâtonnet en bois, des cotons et du kraft, pour permettre aux souris de jouer et avoir une activité diversifiée. Avant les injections sous-cutanées, les souris seront anesthésiées pour éviter l’induction de stress. Des points limites suffisamment précoces et prédictifs ont été définis pour éviter toute douleur, souffrance et angoisse infligée aux animaux. D’ailleurs, nous avons choisi des conditions d’induction de la maladie qui permettent un développement modéré des symptômes de la maladie sans induction de douleur et sans perte significative de poids des aliments spécifiques qui permettront aux souris de s’hydrater et s’alimenter sans difficulté. Le suivi des souris malades deux fois par jour permettra de réagir immédiatement en cas de souffrance. Enfin, nous nous attendons à ce que le blocage de la protéine Pax6 induise la maladie plus tôt et avec un phénotype plus marqué. Si notre hypothèse est correcte, nous allons raccourcir la durée de l’expérience.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Nous travaillons sur la souris, car c’est le meilleur modèle pour créer des animaux transgéniques et comparer le développment des maladies chez ces animaux avec les pathologies humaines. Les souris transgéniques sont largement utilisées dans l’étude des mécanismes physiopathologiques des maladies humaines. Toutes nos données in vitro montrent clairement, et pour la première fois, que la protéine P est exprimée par les macrophages du cerveau et régule l’état inflammatoire de ces cellules. La lignée de souris qui permet d’inactiver la protéine P chez l’animal adulte, exclusivement dans les microglies (les macrophages du cerveau), est un modèle idéal pour étudier le rôle de la protéine P dans le développement de la sclérose en plaques (SEP). Ce modèle de SEP chez la souris est de loin le meilleur moyen de mimer la SEP humaine, l’une des maladies les plus sévères et dévastatrices, liée à une activation aberrante des microglies, qui sont les macrophages du cerveau, et qui jouent un rôle protecteur contre l’inflammation du cerveau. Toutes les souris devront être adultes, âgées de 6 à 8 semaines, parce que la maladie SEP se développe chez l’être humain adulte.