Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 06/06/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-434435)
Abrasion de la cornée, instillation d’endotoxines, ablation des glandes lacrymales et instillations d’un conservateur de collyre deux fois par jour pendant une semaine : 168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur attend les mêmes symptômes que chez les patients humains, picotements, brûlures, larmoiements, sensation de corps étranger et sensibilité accrue à la lumière. L’analgésie s’arrête vingt-quatre heures après la chirurgie, parce qu’au-delà, écrit-il, elle « inhiberait l’évolution du modèle expérimental ». La douleur oculaire que le projet veut comprendre est donc aussi celle qu’il faut laisser s’installer chez les souris pour que l’expérience fonctionne.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La douleur oculaire est un symptôme d’alerte en réaction à une inflammation ou un traumatisme, affectant particulièrement la cornée, la sclérotique et la conjonctive. La douleur oculaire est remarquable par la variabilité de l’intensité qu’elle peut générer, allant d’une simple gêne oculaire à une douleur intense, voire insupportable. Les douleurs chroniques de la surface oculaire entraînent, au-delà de la souffrance exprimée par les patients, une réelle altération de leur qualité de vie puisqu’on estime que près de 60 pourcents des patients sont gênés dans leurs activités quotidiennes. Diverses maladies inflammatoires ou infectieuses, des troubles neurologiques et des interventions chirurgicales oculaires peuvent être la cause sous-jacente de douleur cornéenne chronique. Dans les cas pathologiques graves, les lésions des nerfs cornéens peuvent entraîner une sensibilité accrue à la lumière et/ou des douleurs, une altération des fonctions physiques et sociales, une privation de sommeil, une anxiété et une dépression. Le poids des maladies de la surface oculaire, associant des symptômes douloureux intenses, des comorbidités émotionnelles et des altérations psychosociales, nous a conduit à en étudier les mécanismes sous- jacents. Une meilleure compréhension de ces mécanismes est un des enjeux cruciaux pour le développement de stratégies de prise en charge et de thérapeutiques efficaces pour soulager la douleur oculaire chronique.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
L’objectif est de définir, le rôle fonctionnel de ces chimiokines dans les interactions entre les cellules immunitaires et les neurones sensoriels et leurs implications spécifiques dans les mécanismes d’initiation et de maintien des syndromes douloureux au cours de la douleur oculaire. Globalement, ce projet apportera le rationnel pour l’utilisation des antagonistes des récepteurs de chimiokines comme traitement contre la douleur oculaire chronique. Ainsi, nous faisons l’hypothèse que ces chimiokines après une atteinte cornéenne pourraient induire, le recrutement et l’activation de cellules immunitaires localement au niveau de la lésion cornéenne et dans le système trigéminal, et ainsi participer aux mécanismes conduisant à la centralisation et à la chronicité de la douleur oculaire.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Trois modèles seront mis en œuvre dans le cadre de ce projet. Le modèle douleur inflammatoire est obtenu par des instillations 2 fois par jour pendant 7 jours d’un conservateur de collyre ; il nécessite la contention pendant quelques secondes de l’animal. Le modèle de douleur lié à une infection est induit par l’abrasion de la cornée effectuée sous anesthésie et analgésie (1 fois, 10 minutes) associé à l’instillation d’endotoxines le jour de l’abrasion lors de la même anesthésie (quelques secondes) et une seconde fois 3 jours après sur animal vigile par simple contention (quelques secondes). Le modèle de sécheresse oculaire est induit par exérèse des glandes lacrymales. Cette chirurgie est effectuée sous anesthésie et analgésie et dure au maximum 15 minutes. Ces modèles reproduisant le contexte de la maladie étudiée sont réalisés sous anesthésie et analgésie dans le respect des normes et recommandations concernant le bien-être animal et l’éthique en vigueur
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Modèles : les nuisances attendues dans les 3 modèles sont celles observées chez l’Homme à savoir, des picotements, des démangeaisons, des sensations de brulure, des larmoiements, la sensation de corps étranger dans l’œil, une sensibilité accrue à la lumière. Ces manifestations sont imputables à la composante inflammatoire de la maladie. Le modèle d’instillation répétée d’un conservateur correspond classiquement aux traitements (collyres) donnés aux patients en clinique humaine. Son application topique sur le long terme est connue en clinique humaine pour être toxique pour la surface oculaire et engendrer des gènes ou des irritation ou brûlure, d’œil sec voir une inflammation d’intensité variable. Dans le second modèle, l’abrasion de la cornée entrainera une douleur post-opératoire. L’instillation de toxine entrainera une inflammation de la cornée et une rougeur de la conjonctive. Chirurgie : la chirurgie qui permet de mettre en place le modèle de sècheresse oculaire entrainera une douleur post opératoire. L’anesthésie durant la chirurgie peut entrainer une détresse respiratoire ou cardiaque, une hypothermie. Les nuisances attendues seront celles observées dans la sécheresse oculaire en clinique à savoir des picotements, des démangeaisons, des sensations de brûlure, de corps étrangers dans l’œil, une sensibilité accrue à la lumière.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux sont euthanasiés à l’issue de chaque procédure car les prélèvements d’organes pour analyse post mortem par imagerie sont nécessaires.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
À l’heure actuelle, ce projet nécessite l’utilisation d’animaux car aucune alternative in vitro permet : 1) mimer la pathologie de sécheresse et douleur oculaire qui lui sont liées. 2) la complexité et l’interaction des circuits neuronaux mis en jeu (connectant la cornée, ganglions trigéminés et cerveau) ainsi que l’interaction avec l’activité du système immunitaire inné, ne peuvent également être étudier et remplacer par un modèle d’étude vitro. Bien que les questions soulevées par ce projet visent à mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques mis en jeu au cours de cette pathologie chez l’Homme, il est d’abord nécessaire d’élucider ces points clés à travers l’utilisation d’un modèle rongeur. De plus, une veille bibliographique réalisée confirme qu’à l’heure actuelle, aucun model in silico n’existe pour répondre à ces questions.
2. Réduction
Nous utiliserons au maximum 168 souris dans ce projet d’une durée de 5 ans. Afin de respecter la règle de réduction, notre étude portera sur plusieurs structures (cornée, ganglion trigéminal, cerveaux) de chaque animal. Nous utiliserons un nombre limité de souris et de groupes tout en gardant la significativité des résultats via une analyse statistique adaptée. Le choix de faire 4 animaux par groupe, repose essentiellement sur un choix volontaire de « réduction » tout en satisfaisant le critère de reproductibilité. Cette étude présente en grande partie un aspect descriptif de la distribution et de la forme des cellules n’impliquant pas necessairement de test statistique. Dans cette approche nous considérons chaque animal de manière pairée avec son control, mais aussi au sein même d’un animal (œil control vs œil lésé). Néanmoins des tests statisitiques pourront être réalisés sur certaines quantifications à l’échelle de la cellule unique. Le nombre d’image peut être plus ou moins augmenté par animal, ainsi le nombre de point comparés étant très grand nous atteignons largement les effectifs minimaux requis par les tests de calcul de puissance. Cependant nous satisfaisons aux critères de reproductibilité de la manip en faisant 4 fois cette quantification (2 males et 2 femelles traités vs 4 contrôles). D’expérience si aucune différence n’est observée sur ce nombre d’animaux il ne sert à rien d’accumuler des tests. Cette étude par microscopie et cette approche statistique nous permet donc de travailler avec un nombre réduit d’animaux.
3. Raffinement
Dans le cadre d’une démarche de raffinement nous devons chercher à préserver l’animal de la douleur. Pour cela, les procédures de chirurgie se feront sous anesthésie générale associée à un protocole analgésique en pré-, per- et post-opératoire sur 24h. Au delà de 24h cela inhiberait l’évolution du modèle expérimental et interférerait avec les résultats attendus pour ce projet. Aucun acte ne sera entrepris avant que l’animal ne soit stabilisé pour ses différentes constantes. Si un animal anesthésié lors de l’induction du modèle présentait une détresse respiratoire ou cardiaque ou s’il se trouve en hypothermie, nous procéderons à un arrêt immédiat du protocole en cours. Au delà des 24h post-op, le bien être animal sera évalué à l’aide de points limites établis. Toute observation anormale sera notée dans un tableau des points limites et nous suivrons l’échelle décisionnelle que nous avons définie afin de limiter au maximum la souffrance prolongée. Afin de réduire le stress et l’anxiété, les animaux seront reçus une semaine avant le début des expérimentations. Chaque cage contient au moins un élément d’enrichissement, bâton à ronger ou tunnel en carton. Les enrichissements de nidification (craft, ouate) sont exclus pour réduire les risque de poussière dans les yeux, la litière utilisée a été validée par la structure pour son faible taux de poussière. Les animaux sont hébergés dans les conditions de notre établissement avec température et hygrométrie contrôlée, cycle jour/nuit 12/12, avec au maximum 5 animaux par cages. La surveillance quotidienne du bien-être animal est prise en charge par un personnel dédié au soin et à l’expérimentation. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies à volonté.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le développement de modèles précliniques chez la souris est hautement reconnu et utilisé en routine pour la recherche portant sur la douleur oculaire. La souris de laboratoire est l’animal de choix car elle possède les structures oculaires et cérébrales adéquates, et que nous avons accès à tous les outils génétiques requis. Les animaux arriveront à l’animalerie à l’âge de 7-8 semaines et entreront en procédure entre 10 et 12 semaines. Cela permettra de travailler sur des souris adultes tout en évitant des biais liés au changement physiologique de l’animal vieillissant. En effet l’ensemble des procédures de ce projet durant entre 4 à 11 semaines maximum. Les souris auront donc au maximum 23 semaines en sortie de procédure.