Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 2025-07-24 00:00:00
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-171252)
Un antibiotique choisi pour sa toxicité rénale est injecté à 48 petites roussettes juvéniles, de jeunes requins, afin de détruire une partie de leurs néphrons et d’observer comment le rein se reconstruit. Elles subissent une à quatre anesthésies et restent trois semaines en aquarium, dans des procédures classées à un niveau de souffrance léger. Le RNT chiffre la nuisance de l’injection à quelques secondes et celle qui suit à trois semaines, sans autre qualification que « faible », alors que la lésion rénale est le but même du protocole. Toutes seront tuées à l’issue pour que leurs reins soient coupés en lames d’histologie, environ trois cents par individu.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Note de l'OXA. Cette question est celle du formulaire européen de résumé non technique. Elle est posée au laboratoire qui demande l'autorisation, et sa réponse est écrite avant que la première procédure commence (arrêté du 1er février 2013, art. 5). Ces objectifs servent à justifier l'utilisation des animaux devant le comité d'éthique. Aucun document public ne dira ensuite s'ils ont été atteints : la directive permet aux États de faire mettre à jour le résumé avec les résultats de l'appréciation rétrospective (directive 2010/63/UE, art. 43), la base européenne prévoit de les recevoir, et aucune entrée française n'en porte (base ALURES).
Le rein est un organe essentiel pour, entre autre, maintenir l’homéostasie des fluides dans le corps, pour la régulation de la pression artérielle et pour l’élimination des déchets. L’unité fondamentale du rein est le néphron, composé d’une structure où se fait la filtration du sang et d’un ensemble de tubules acheminant le produit de filtration. Les néphrons sont issus d’une population de cellules souches présentes dans le rein uniquement pendant l’embryogenèse chez les mammifères. Suite à une lésion, les mammifères peuvent réparer les néphrons existants mais ne peuvent pas former de nouveaux néphrons. A l’inverse, les requins et les raies sont capables de former de nouveaux néphrons tout au long de la vie. Cela a également été montré de manière expérimentale chez la raie hérisson suite à une néphrectomie partielle chez l’adulte. La possibilité de former de nouveaux néphrons chez les poissons cartilagineux tout au long de la vie est liée à la persistance des cellules souches dans le rein au-delà de l’embryogenèse. Ces animaux sont donc des modèles très intéressants pour étudier les mécanismes moléculaires sous-tendant la régénération des néphrons. La mise à jour de ces mécanismes dans ces espèces pourrait permettre la réactivation du processus de formation de nouveaux néphrons chez les mammifères et ainsi aider à la récupération de la fonction rénale dans le cas de maladie chronique. Notre objectif est donc ici d’étudier la cinétique de régénération rénale chez la petite roussette, un petit requin abondant dans l’Atlantique Nord. Les lésions rénales seront induites par une méthode moins drastique que la néphrectomie partielle qui demande en outre une maîtrise chirurgicale de pointe. Comme alternative, nous utiliserons un antibiotique connu pour son effet nephrotoxique et non létal à des doses modérées. Ce modèle de régénération rénale induite par des lésions à la gentamicine a déjà été décrit sur des poissons téléostéens (poisson zèbre) adultes.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Note de l'OXA. Le formulaire européen demande les bénéfices « susceptibles de découler » du projet. Il appelle donc une projection, et il l'obtient : ce que le laboratoire écrit ici est ce qu'il espère, avant d'avoir commencé. Deux chercheuses ont repris six corpus d'études précliniques déjà menées et pesé les dommages réellement infligés aux animaux contre les bénéfices cliniques réellement obtenus : moins de 7 % de ces études ressortaient défendables (Pound et Nicol, 2018).
Bien que les propriétés de régénération rénale chez les requins soient connues depuis plus de 30 ans, aucune étude n’a encore envisagé d’analyser de manière histologique et moléculaire la cinétique de régénération rénale chez ces animaux suite à une lésion néphrotoxique d’ordre chimique. La mise en évidence de nouveaux néphrons chez la raie hérisson après une ablation partielle du rein a pu montrer que le processus de régénération n’était pas simplement physiologique mais pouvait aussi être induit lors d’une ablation partielle du rein, c’est-à-dire dans un contexte traumatique. Quels changements moléculaires subissent les cellules souches du néphron pour s’engager dans la formation de nouveaux néphrons suite à une lésion néphrotoxique? C’est la question que nous proposons d’explorer dans ce projet au travers du protocole d’injection d’un antibiotique dans des roussettes juvéniles. Ce projet nous permettra donc de déchiffrer les mécanismes moléculaires mis en œuvre dans la formation de nouveaux néphrons dans un contexte pathologique. La possibilité d’induire ces mécanismes moléculaires dans le but de réactiver la formation de nouveaux néphrons pourra alors un jour être testée chez les mammifères, ce qui pourrait ouvrir des perspectives thérapeutiques dans le cadre de maladies rénales chroniques.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Note de l'OXA. La formule « en règle générale » autorise une réponse générale, et c'est l'un des points sur lesquels les examens de qualité trouvent ces documents défaillants. Cruelty Free International a établi en 2018 que les résumés allemands et britanniques, les seuls examinés à ce jour, décrivaient mal ce qui est fait aux animaux et ce que ceux-ci pourraient éprouver (Taylor et al., 2018). L'adoption d'un modèle commun européen a nettement amélioré le premier point, à peine le second (Taylor et al., 2024).
Les juvéniles seront soumis à une injection sous anesthésie puis placés dans un bac de réveil. Pendant la durée de l’expérience (3 semaines), les juvéniles sont maintenus dans des aquariums de 100 L. Les roussettes juvéniles seront soumises, selon les groupes, à une, deux, trois ou quatre anesthésies de quelques minutes chacune.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Note de l'OXA. C'est l'endroit du document où les animaux devraient apparaître, et c'est celui qui résiste. Cruelty Free Europe a mesuré en 2024 que cinq des six éléments attendus sur les dommages prévus progressaient depuis l'adoption d'un modèle commun européen. Les effets indésirables sont le sixième : 41 % des résumés allemands et 48 % des britanniques les décrivent complètement. Les auteurs relèvent aussi des effets présentés comme minimes sur des projets classés modérés ou sévères (Taylor et al., 2024). Ces deux pays sont les seuls dont les résumés ont été examinés. Les résumés français relèvent du même modèle européen, et leur qualité n'a jamais été mesurée.
Nuisances lors de la pêche des juvéniles L’intensité de cette nuisance est faible et sa durée est d’une dizaine de secondes (transfert du bac où les juvéniles ont éclos vers la pièce voisine). Nuisances lors de la procédure d’injection L’intensité de cette nuisance est faible et sa durée est de quelques secondes (injection de 100 microlitres de solution) Nuisances après l’injection L’intensité de cette nuisance est faible et sa durée est de 3 semaines.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Note de l'OXA. Le formulaire demande de justifier ce sort, non de le décrire. L'analyse dommage-avantage que la directive impose au comité d'éthique porte sur « la souffrance, la douleur et l'angoisse » infligées aux animaux (directive 2010/63/UE, art. 38). Quand ce sort est la mise à mort, celle-ci ne figure donc pas parmi les dommages que le comité met en balance avec les bénéfices annoncés. L'OXA écrit « mise à mort » plutôt que « sacrifice », qui emprunte au registre du don consenti, ou « euthanasie », qui désigne une mort décidée dans l'intérêt de celui qui meurt.
Tous les juvéniles utilisés dans notre expérience seront mis à mort pour réaliser des prélèvements et procéder à des analyses.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Note de l'OXA. La directive demande au résumé « une démonstration de la conformité » aux exigences de remplacement, de réduction et de raffinement (directive 2010/63/UE, art. 43). C'est donc le demandeur qui démontre sa propre conformité, dans le document même qui sollicite l'autorisation. Cette démonstration peut prendre la forme d'une affirmation qu'aucune méthode de substitution n'existe, que le document n'a pas à sourcer. Ces trois exigences sont par ailleurs subordonnées à l'objectif du projet : elles cherchent à remplacer les animaux dans un projet donné, elles n'interrogent pas ce projet.
Les animaux choisis dans cette étude (les requins) possèdent une propriété biologique bien particulière: la possibilité de former de nouveaux néphrons tout au long de la vie et ceci dans un contexte à la fois physiologique (génération perpétuelle de néphrons) et traumatique (régénération de néphrons après une lésion mécanique). Cette propriété n’est pas présente chez les mammifères indiquant qu’elle s’est perdue au cours de l’évolution. Il est donc nécessaire de se tourner vers les requins pour étudier les mécanismes moléculaires qui sous-tendent cette régénération. Ces mécanismes, qui impliquent d’analyser le comportement des cellules souches du néphron, doivent être étudiés dans l’animal entier. En effet, on sait aujourd’hui que le microenvironnement des cellules souches est un élément crucial pour indiquer si ces cellules doivent se différentier ou s’auto-renouveler. Nous avons également consulté l’annuaire des compétences en méthodes substitutives (AREA) afin de vérifier qu’il n’existe pas de modèles organoïdes chez les requins en France. Il n’en existe pour aucun organe chez ce groupe d’animaux. La règle de remplacement de l’animal entier ne peut donc pas être appliquée dans ce projet.
2. Réduction
Note de l'OXA. La réduction dont il est question ici porte sur le nombre d'animaux par groupe expérimental, calculé pour que l'analyse statistique tienne. Le total annoncé dans la fiche est une estimation portant sur une autorisation de cinq ans au maximum (code rural, art. R214-123) : il ne dit pas combien d'animaux seront effectivement utilisés, et il ne se rapporte pas à une année.
Seulement 3 juvéniles seront analysés à chaque point de collecte (4 points de collecte en tout: Jour 2, semaine 1, semaine 2 et semaine 3). Les analyses suivant l’injection vont se faire sur des coupes d’échantillon enrobé dans de la paraffine. Chaque juvénile peut fournir environ 300 coupes de paraffine (épaisseur de chacune: 10 micromètres) offrant ainsi un nombre important de support pour collecter des mesures. Par exemple, au point de collecte «semaine 1», 3 juvéniles vont être prélevés. Chaque juvénile va fournir 300 coupes. Cent coupes pourront entrer dans l’analyse 1 offrant la possibilité de faire 100 mesures. Trois juvéniles étant analysés, 300 mesures peuvent être collectés. L’expérience étant répétée deux fois, nous pouvons obtenir 2 x 300 mesures pour l’analyse 1. L’utilisation de seulement 3 juvéniles est donc largement suffisante pour fournir un nombre important de mesures et pour permettre de réaliser des tests statistiques. La règle de réduction peut être appliquée.
3. Raffinement
Note de l'OXA. Le raffinement nomme une amélioration technique de la procédure, sans dire ce qu'elle change pour l'animal qui la subit. La réglementation impose d'atténuer la douleur, dans une limite qu'elle inscrit elle-même : « pour autant que cela soit compatible avec la finalité de la procédure expérimentale » (code rural, art. R214-109). Ce qui reste de souffrance après cette limite est autorisé. Le raffinement ne porte par ailleurs que sur la procédure : les souffrances de la captivité elle-même, confinement, bruit, lumière, manipulations d'entretien, ne relèvent d'aucun des trois R.
Nous allons utiliser un anesthésique à deux reprises lors de la manipulation des juvéniles: lors de l’injection des solutions puis avant la mise à mort. Avant la mise à mort des animaux, ceux-ci seront maintenus dans des aquariums jusqu’à 3 semaines après l’injection des solutions. Dans chaque aquarium, un enrichissement environnemental sera proposé aux animaux sous la forme de pièce en pvc de taille adaptée pour que les animaux puissent se cacher à l’intérieur si besoin. Une nourriture variée et adaptée sera proposée à satiété aux juvéniles: colin, calamar et crevettes rose. Pendant cette période de 3 semaines où les animaux seront dans les aquariums, ils seront observés quotidiennement. Nous avons établi une grille de suivi des juvéniles après l’injection. Grâce à cette grille nous nous assurerons que les animaux injectés avec de la solution expérimentale se comportent comme les animaux injectés avec la solution contrôle. Le suivi des animaux inclut des points limites stricts et spécifiques du projet.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Note de l'OXA. Le dossier d'autorisation demande de justifier l'origine des animaux, leur espèce, leur nombre estimé et leur stade de développement (arrêté du 1er février 2013, art. 5). La justification attendue est technique : elle porte sur l'adéquation de l'espèce à l'objectif poursuivi. Ce que l'appartenance à une espèce autorise à faire subir à un individu est une question morale, et le formulaire ne la pose pas. L'appartenance à une espèce, prise seule, ne fonde pourtant pas de différence de statut moral entre des individus également capables de souffrir.
L’espèce choisie est la petite roussette. Cette espèce appartient au rang taxinomique des poissons cartilagineux qui regroupent les requins, les raies et les chimères. Une étude a montré en 2003 que les poissons cartilagineux possédaient la capacité de régénérer le rein après une néphrectomie partielle. L’union internationale pour la conservation de la nature (UICN) a défini le statut de conservation de la petite roussette comme « préoccupation mineure ». Comme nous étudions un processus de régénération, nous ne pouvons pas travailler sur l’embryon. L’embryogenèse d’un organisme correspond à une étape de croissance et développement intense qui ne peut être assimilé à de la régénération. La régénération ne peut être analysée qu’au stade post-embryonnaire. Comme il s’agit d’expériences qui n’ont encore jamais été réalisées, il nous semblait difficile de les réaliser d’emblée sur des adultes. Notre choix s’est donc porté sur les juvéniles. Ils sont de petites tailles et facile à manipuler. Les roussettes seront utilisées au stade juvénile. Comme nous étudions un processus de régénération, nous ne pouvons pas travailler sur l’embryon. L’embryogenèse d’un organisme correspond à une étape de croissance et développement intense qui ne peut être assimiler à de la régénération. La régénération ne peut être analysée qu’au stade post-embryonnaire. Comme il s’agit d’expériences qui n’ont encore jamais été réalisées, il nous semblait difficile de les réaliser d’emblée sur des adultes. Notre choix s’est donc porté sur les juvéniles. Ils sont de petites tailles et facile à manipuler.