Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 28/07/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-113187)
530 poissons produits par lignée étudiée, sur trois générations de croisements, pour n’analyser au bout du compte que les ovaires des femelles homozygotes. 2 650 médakas vont être utilisés, tous tués à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque poisson subit sous anesthésie le prélèvement d’un fragment de nageoire caudale de moins de 2 mm² pour génotypage, puis reste isolé jusqu’à 24 heures dans l’attente du résultat. Les femelles retenues sont tuées par surdosage d’anesthésiant et leurs ovaires prélevés, l’écart entre les 2 650 individus élevés et le petit nombre réellement analysé restant sans chiffrage.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’insuffisance ovarienne prématurée (IOP) touche jusqu’à 4 % des femmes et constitue une cause majeure d’infertilité féminine. Bien que l’IOP ait souvent une origine génétique, la cause sous-jacente demeure inconnue dans 70 % des cas, soulignant ainsi la nécessité urgente d’un diagnostic clinique plus efficace pour une meilleure prise en charge de l’infertilité. L’identification des causes génétiques de l’IOP est un défi en raison du grand nombre de gènes impliqués dans le développement et le fonctionnement normal des ovaires, ainsi que de la difficulté à établir un lien de causalité entre les mutations identifiées chez les patientes et le diagnostic clinique. Ce projet vise à relever ces défis en exploitant un modèle de poisson vertébré pour démontrer la relation causale entre des gènes candidats spécifiques et l’IOP. Notre hypothèse est que l’analyse fonctionnelle de ces gènes dans notre modèle permettra vérifier si une mutation est responsable d’un dysfonctionnement de l’ovaire, contribuant ainsi à améliorer le diagnostic clinique. De plus, nous réaliserons une caractérisation approfondie de la folliculogenèse à l’aide d’imageries 3D de pointe et en analysant quels gènes sont exprimés dans chaque cellule, afin d’éclairer les voies moléculaires impliquées dans l’IOP et d’identifier d’éventuelles cibles thérapeutiques.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
De plus, l’utilisation d’un modèle in vivo combinée à des approches de phénotypage avancées, à la fois macroscopiques (phénotypage reproductif et analyse 3D des ovaires) et transcriptomiques, représente une avancée méthodologique majeure. En effet, à ce jour, aucun modèle animal n’existe pour l’étude de ces gènes dans la fonction ovarienne. Cette approche innovante pourrait donc combler un vide important dans le domaine de la recherche sur l’IOP et offrir un modèle fiable et reproductible pour étudier l’impact de ces mutations sur la fonction ovarienne. Enfin, ce projet s’appuie sur des données de séquençage issues d’une cohorte de patientes IOP et bénéficie d’une reconnaissance institutionnelle, notamment par l’Agence de Biomédecine. Son impact dépasse ainsi le cadre fondamental, avec des perspectives d’applications biomédicales concrètes pour le diagnostic et la prise en charge de l’IOP.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les animaux subiront dans un premier temps un prélèvement de morceaux de nageoire caudale pour génotypage afin d’établir une lignée mutante. Les femelles mutantes seront prélevées pour leurs ovaires post-mortem. Le prélèvement des œufs ne nécessite pas d’anesthésie, les œufs sont prélevés à la main après capture de la femelle. Les œufs une fois pondus restent accrochés à l’abdomen de la femelle ce qui facilite leur collecte. Les animaux subiront, sous anesthésie, un prélèvement d’un petit fragment de nageoire caudale (moins de 2 mm²) afin de permettre leur génotypage et l’établissement des lignées mutantes. L’anesthésie est réalisée par balnéation en anesthésiant assurant l’absence de réflexes et de douleur pendant la procédure qui ne dure que quelques minutes (moins de 3 minutes/poisson). L’isolement temporaire des poissons est inférieur à 24h, le temps d’obtenir le résultats de génotypage. Après identification des femelles mutantes, celles-ci seront prélevées à des stades spécifiques du protocole. Elles seront euthanasiées par surdosage de d’anesthésiant, et la mort sera confirmée par l’arrêt des mouvements respiratoires et l’absence de réflexes. Les ovaires seront ensuite prélevés post-mortem pour les analyses prévues. »
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les gènes ciblés dans ce projet jouent un rôle crucial dans le développement et la fonction ovarienne, notamment dans la maturation folliculaire, la régulation de la division cellulaire, la stabilité génétique et la transcription. Leur invalidation est susceptible d’entraîner des altérations de la fertilité, de la croissance folliculaire ou de la qualité des ovocytes. Cependant, l’inactivation génique peut également provoquer des effets hors cible, c’est-à-dire des mutations involontaires en dehors des gènes ciblés. Ces effets sont difficilement prédictibles et peuvent avoir des conséquences variables sur d’autres fonctions physiologiques, allant d’effets bénins à des perturbations plus significatives. Bien que des stratégies de validation et de sélection des lignées soient mises en place pour limiter ces risques, il n’est pas possible de les exclure totalement. Par ailleurs, la procédure de génotypage nécessite une biopsie de la nageoire caudale pratiquée sous anesthésie. Cette intervention peut entraîner une douleur légère et transitoire, bien que des mesures de raffinement soient mises en œuvre pour en limiter l’impact (anesthésie, taille réduite du prélèvement
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
les animaux sont euthanasiés après 3 générations pour l’analyse de leurs organes.(ovaires)
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Les cellules épithéliales ovariennes peuvent être étudiées dans des modèles in vitro de culture. Cependant, ces modèles ne permettent pas actuellement de reproduire la complexité de l’environnement ovarien in vivo, notamment la présence de cellules germinales à différents stades de la folliculogenèse. En outre, ils ne prennent pas en compte l’ensemble des autres types cellulaires qui composent l’ovaire et qui interagissent pour réguler son développement, telles que les cellules immunitaires, les cellules somatiques de soutien , et les cellules endothéliales, entre autres. Ces interactions cellulaires jouent un rôle crucial dans le bon fonctionnement de l’ovaire et dans la régulation des processus de folliculogenèse. De plus, il n’existe actuellement pas d’alternative viable pour étudier le rôle des gènes ciblés dans ce projet au sein d’un modèle expérimental qui reflète cette complexité biologique. L’expérimentation in vivo permet de comprendre de manière réaliste les interactions entre ces différents types cellulaires et leur impact sur le développement ovarien. Par conséquent, elle reste indispensable pour étudier le rôle des gènes ciblés et leurs effets sur la fonction ovarienne dans son ensemble.
2. Réduction
Dans ce projet, nous prévoyons de produire 530 poissons pour chaque lignée étudiée. Ces poissons proviennent d’un programme d’élevage en plusieurs étapes. D’abord, des poissons génétiquement modifiés (appelés F0) sont croisés avec des poissons « sauvages » (c’est-à-dire sans modification génétique). Cela donne une première génération (appelée F1) composée pour moitié d’individus porteurs d’une seule copie de la mutation étudiée (hétérozygotes). Ensuite, pour obtenir la génération F2, nous croisons ces F1 hétérozygotes avec d’autres poissons sauvages. Ce croisement permet d’obtenir, une moitié des animaux hétérozygotes, un quart d’animaux qui possèdent deux copies de la mutation (appelés homozygotes mutant) et un quart qui n’en portent aucune (animaux dits homozygotes « sauvages »). C’est parmi ces homozygotes que seront sélectionnés les poissons pour les expériences, car ils expriment pleinement les effets de la mutation. Une génération F3 sera produite à partir de poissons F2 porteurs d’une seule copie de la mutation (hétérozygotes), selon les mêmes principes de répartition génétique. Tout au long du processus, le nombre d’animaux produits sera limité au strict nécessaire pour garantir des résultats fiables dans les différentes analyses prévues (observation des effets visibles, étude de l’expression des gènes, et imagerie 3D des ovaires). Cela permet de respecter au mieux le principe de réduction du nombre d’animaux utilisés, sans compromettre la qualité scientifique du projet.
3. Raffinement
Les animaux sont élevés dans les conditions optimales de l’espèce (température, photopériode, qualité d’eau, densité). Les enrichissements faits de plantes seront aussi installés dans les aquariums, sachant que les animaux sont maintenus en aquariums contenant 9,5 litres avec la densité de 25 animaux maximum/aquarium. Les manipulations des animaux comme la manipulation pour la mise en ponte, le prélèvement d’oeufs ou la mise en balnéation seront réalisées le plus rapidement pour limiter le stress dû à la préhension. Le comportement des animaux sera observé quotidiennement. Par ailleurs, si une pathologie infectieuse se déclarait chez un animal (imputable ou non à l’invalidation génique des gènes cibles) alors ce-dernier sera suivi par le vétérinaire qui supervise le cheptel du laboratoire. C’est lui qui prendra les décisions les plus appropriées pour maintenir le bien- être de l’animal (pouvant conduire éventuellement à l’euthanasie de ce dernier) et la structure bien être animal de notre établissement sera immédiatement avertie. . Pendant la procédure de biopsie pour le génotypage, les animaux sont anesthésiés par balnéation dans une solution de tricaïne. L’efficacité de l’anesthésie est confirmée par le ralentissement net des mouvements respiratoires et l’absence de réponse à un pincement de la nageoire caudale. Une biopsie d’environ 2 mm2 est prélevée à l’extrémité de la nageoire caudale à l’aide de ciseaux fins désinfectés. Cette procédure, brève et peu invasive, ne génère qu’un inconfort léger et transitoire. Afin de limiter la douleur potentielle, l’anesthésie est maintenue pendant toute la durée de la manipulation, et les animaux sont replacés en eau propre pour un réveil progressif. Après la biopsie, les animaux sont isolés individuellement pour une durée maximale de 24 heures, en attendant les résultats du génotypage. Bien qu’en aquarium individuel, le contact visuel avec leurs congénères est préservé afin de limiter le stress lié à l’isolement. Bien que cette méthode soit sans risque notable et maîtrisée, tout poisson montrant des signes de mal-être ou de comportement anormal dans les 24h suivant la biopsie est immédiatement retiré de l’expérimentation et euthanasié selon les procédures définies.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Les poissons téléostéens, tels que le medaka (Oryzias latipes), représentent une alternative plus efficace que les modèles de rongeurs pour l’étude de pathologies au diagnostic complexe. L’absence de placenta et le développement externe des œufs transparents, facilitent l’observation des premières étapes du développement. Le Medaka pond environ 20 œufs par jour, offrant ainsi un accès direct au développement embryonnaire et larvaire précoce — des informations souvent inaccessibles dans les modèles mammaliens. De plus, comme le génome du médaka est entièrement séquencés, l’étude des fonctions des gènes peut être réalisée efficacement grâce aux technologies de modification génétique, permettant de répliquer facilement des mutations génétiques observées chez des patientes. En outre, 66 % des gènes liés aux maladies humaines ont un équivalent clair chez le médaka, ce qui en fait un modèle excellent pour mieux comprendre les pathologies génétiques humaines, comme l’IOP. Les animaux F2 homozygotes sauvages et mutants seront utilisés à l’âge adulte, soit à partir de 3 mois, au moment de leur maturité sexuelle, afin d’analyser leur capacité de reproduction pendant une période minimale de 70 jours. Concernant les analyses d’imagerie : la moitié des femelles sera euthanasiée dès 3 mois pour évaluer l’état de leur composition ovarienne, tandis que l’autre moitié sera euthanasiée après les 70j de phénotypage de reproduction. Cela permettra de relier chaque phénotype de reproduction observé à la composition ovarienne correspondante. Pour la génération F3, les femelles euthanasiées entre 3 mois et 3 mois et 70 jours (dépendamment des résultats de phénotypage des pontes obtenues sur les F2 et leur ovaire sera prélevé pour des analyses transcriptomiques poussées permettant de connaitre l’expression des gènes au niveau cellulaire.