Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 2025-09-11 00:00:00
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-173311)
Deux passages d’IRM par semaine sous anesthésie générale, pendant jusqu’à quatre-vingts jours, attendent chacune des 404 souris du projet. Toutes sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et tuées pour récupérer leur cerveau. Après l’implantation d’un glioblastome humain dans le cerveau, 192 reçoivent une irradiation cérébrale de 15 Gy en une séance et 288 une injection intracrânienne de lymphocytes T modifiés, le porteur attendant une perte de poids, de motricité et de sensibilité. Les souris NSG sont choisies pour leur absence d’immunité, qui permet la greffe de cellules humaines et évite les réactions contre le traitement, et le porteur ajoute que le laboratoire partenaire maîtrise déjà ce modèle.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Note de l'OXA. Cette question est celle du formulaire européen de résumé non technique. Elle est posée au laboratoire qui demande l'autorisation, et sa réponse est écrite avant que la première procédure commence (arrêté du 1er février 2013, art. 5). Ces objectifs servent à justifier l'utilisation des animaux devant le comité d'éthique. Aucun document public ne dira ensuite s'ils ont été atteints : la directive permet aux États de faire mettre à jour le résumé avec les résultats de l'appréciation rétrospective (directive 2010/63/UE, art. 43), la base européenne prévoit de les recevoir, et aucune entrée française n'en porte (base ALURES).
Le glioblastome (GBM) est une tumeur cérébrale maligne dont l’hétérogénéité et l’agressivité limitent l’efficacité du traitement. Parmis les nouveaux enjeux thérapeutiques, l’immunothérapie constitue une piste intéressante. A ce jour, la meilleure approche d’immunothérapie réside dans le transfert cellulaire adoptif, basé sur l’administration d’effecteurs cellulaires immunitaires spécifiques aux antigènes tumoraux afin de stimuler et promouvoir la prolifération, l’expansion et le maintien des fonctions effectrices immunitaires anti-tumorales. L’utilisation de cette technique avec des cellules T modifiées par des récepteurs antigéniques chimériques (CAR) représente une piste thérapeutique pertinente contre les GBM. Ce projet a ainsi pour but d’évaluer l’efficacité préclinique d’un transfert adoptif de lymphocytes T Vγ9Vδ2-CAR (LTgd) expriment un CAR dirigé contre la forme acétylée du disialoganglioside GD2 (CAR-OAcGD2), cible prometteuse pour la thérapie par cellules CAR T contre les GBM. Le protocole d’injection du traitement par CAR-LT (ou solution saline) correspond à une injection intracrânienne intratumorale à un débit de 0.6µL/min. Cette procédure d’administration fait suite à une précédente saisine.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Note de l'OXA. Le formulaire européen demande les bénéfices « susceptibles de découler » du projet. Il appelle donc une projection, et il l'obtient : ce que le laboratoire écrit ici est ce qu'il espère, avant d'avoir commencé. Deux chercheuses ont repris six corpus d'études précliniques déjà menées et pesé les dommages réellement infligés aux animaux contre les bénéfices cliniques réellement obtenus : moins de 7 % de ces études ressortaient défendables (Pound et Nicol, 2018).
Le bénéfice attendu est une amélioration des stratégies thérapeutiques actuelles pour les tumeurs cérébrales (GBM).
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Note de l'OXA. La formule « en règle générale » autorise une réponse générale, et c'est l'un des points sur lesquels les examens de qualité trouvent ces documents défaillants. Cruelty Free International a établi en 2018 que les résumés allemands et britanniques, les seuls examinés à ce jour, décrivaient mal ce qui est fait aux animaux et ce que ceux-ci pourraient éprouver (Taylor et al., 2018). L'adoption d'un modèle commun européen a nettement amélioré le premier point, à peine le second (Taylor et al., 2024).
Les animaux sont soumis à plusieurs types d’interventions : – chirurgie : implantation de tumeurs cérébrales sous anesthésie générale, 20 minutes par animal maximum, réalisée une fois sur chaque animal. 404 animaux sont concernés. – imagerie IRM : pour suivie de la croissance tumorale : sous anesthésie générale, 10 minutes par animal maximum, réalisée deux fois par semaine jusqu’à 80 jours. 404 animaux sont concernés. – radiothérapie : irradiation cérébrale (15 Gy en une fraction) sous anesthésie générale, 15 minutes par animal maximum, réalisée une fois sur chaque animal. 192 animaux sont concernés. – injection intracrânienne du traitement sous anesthésie générale, 30 minutes par animal maximum, réalisée une fois sur chaque animal. 288 animaux sont concernés.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Note de l'OXA. C'est l'endroit du document où les animaux devraient apparaître, et c'est celui qui résiste. Cruelty Free Europe a mesuré en 2024 que cinq des six éléments attendus sur les dommages prévus progressaient depuis l'adoption d'un modèle commun européen. Les effets indésirables sont le sixième : 41 % des résumés allemands et 48 % des britanniques les décrivent complètement. Les auteurs relèvent aussi des effets présentés comme minimes sur des projets classés modérés ou sévères (Taylor et al., 2024). Ces deux pays sont les seuls dont les résumés ont été examinés. Les résumés français relèvent du même modèle européen, et leur qualité n'a jamais été mesurée.
L’établissement du modèle de tumeur cérébrale est permis grâce à une procédure chirurgicale sévère qui peut induire des douleurs. Les animaux recevront une prise en charge analgésique pré- et post-opératoire et seront surveillés jusqu’à leur réveil, puis replacés dans leur cage et remis à l’animalerie. Les animaux seront surveillés quotidiennement. D’après l’expérience du laboratoire concernant les procédures expérimentales, nous nous attendons à observer une perte de poids, de motricité et de sensibilité chez les aniamux ayant développé un GBM, suite à l’injection (procédure sévère). Les séquences d’imagerie par IRM (procédure légère) n’induisent pas de douleur, de perte de poids ou de perturbation du comportement, mais elles peuvent induire un autre point limite qui est défini pendant l’acquisition IRM : c’est la diminution de la fréquence respiratoire en deçà de 30 respirations par minutes. S’il est atteint et que la diminution du pourcentage d’isoflurane ne suffit pas à augmenter la fréquence respiratoire, la procédure sera arrêtée. A chaque sortie des animaux de la zone EOPS, lors des séquences d’imagerie par IRM, un risque d’infection ou de contamination par les autres animaux n’ayant pas de phénotype dommageable existe. D’après l’expérience du laboratoire, la radiothérapie cérébrale (procédure légère) induit une perte de poids transitoire chez les animaux.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Note de l'OXA. Le formulaire demande de justifier ce sort, non de le décrire. L'analyse dommage-avantage que la directive impose au comité d'éthique porte sur « la souffrance, la douleur et l'angoisse » infligées aux animaux (directive 2010/63/UE, art. 38). Quand ce sort est la mise à mort, celle-ci ne figure donc pas parmi les dommages que le comité met en balance avec les bénéfices annoncés. L'OXA écrit « mise à mort » plutôt que « sacrifice », qui emprunte au registre du don consenti, ou « euthanasie », qui désigne une mort décidée dans l'intérêt de celui qui meurt.
A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort dans le but de récupérer le cerveau pour des analyses post-mortem.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Note de l'OXA. La directive demande au résumé « une démonstration de la conformité » aux exigences de remplacement, de réduction et de raffinement (directive 2010/63/UE, art. 43). C'est donc le demandeur qui démontre sa propre conformité, dans le document même qui sollicite l'autorisation. Cette démonstration peut prendre la forme d'une affirmation qu'aucune méthode de substitution n'existe, que le document n'a pas à sourcer. Ces trois exigences sont par ailleurs subordonnées à l'objectif du projet : elles cherchent à remplacer les animaux dans un projet donné, elles n'interrogent pas ce projet.
Les tumeurs de type GBM sont connues pour être multi-compartimentales, hétérogènes et caractérisées par une immunosuppression forte. Au-delà du compartiment tumoral, d’autres composantes jouent un rôle essentiel dans la réponse au traitement, telles que la vascularisation, l’hypoxie et l’immunité. Leurs interactions réciproques avec les cellules tumorales influencent la réponse au traitement et la survie des patients. L’utilisation de modèles in vivo permet d’intégrer ces différentes composantes, indispensables à la compréhension des mécanismes de développement tumoral et de réponses aux traitements. Ce projet a été initié sur des cultures de lignées humaines de GBM afin de déterminer le comportement des cellules de ces lignées de GBM. Ce projet ne peut cependant pas être intégralement effectué sur ces modèles de remplacement in vitro ou in silico.
2. Réduction
Note de l'OXA. La réduction dont il est question ici porte sur le nombre d'animaux par groupe expérimental, calculé pour que l'analyse statistique tienne. Le total annoncé dans la fiche est une estimation portant sur une autorisation de cinq ans au maximum (code rural, art. R214-123) : il ne dit pas combien d'animaux seront effectivement utilisés, et il ne se rapporte pas à une année.
L’utilisation de méthodes d’imagerie non-invasives se conforme à la réglementation en vigueur dans le respect de la réduction du nombre d’animaux car elles permettent de suivre à différents temps l’évolution de la tumeur chez le même animal sans nécessité d’euthanasie de plusieurs animaux à chaque temps. Chaque animal constitue dans ce cas son prorpre contrôle et permet de réduire le nombre total d’animaux nécessaires pour l’étude. Pour pouvoir obtenir des analyses statistiques robustes, ces simulations ont été faites à l’aide d’un l’outil statistique en ligne et selon des données préliminaires acquises dans l’unité, pour lesquelles la survie du modèle murin de glioblastome du 1er groupe (tumeur) est de 28 jours et celle du 2ème groupe (tumeur + radiothérapie) est de 10 jours. Les paramètre saisis sur BiostaTGV sont les suivants : valeur de variabilité = 14 (écart type commun σ), risque de première espèce α = 0.05, puissance 1-β = 0.8, avec un test de nature bilatéral. Un nombre de 12 animaux par sous-groupe de traitement est donc nécessaire afin d’obtenir une différence significative avec une valeur statistique de 5 % pour un effet de 80 % du traitement. Ce nombre d’animaux est considéré comme maximum et pourra être revu à la baisse durant l’étude. Nous justifions également le nombre d’animaux par sous-groupe d’après l’expérience du laboratoire et la DAP issue du laboratoire collaborateur au projet.
3. Raffinement
Note de l'OXA. Le raffinement nomme une amélioration technique de la procédure, sans dire ce qu'elle change pour l'animal qui la subit. La réglementation impose d'atténuer la douleur, dans une limite qu'elle inscrit elle-même : « pour autant que cela soit compatible avec la finalité de la procédure expérimentale » (code rural, art. R214-109). Ce qui reste de souffrance après cette limite est autorisé. Le raffinement ne porte par ailleurs que sur la procédure : les souffrances de la captivité elle-même, confinement, bruit, lumière, manipulations d'entretien, ne relèvent d'aucun des trois R.
À leur arrivée, les animaux seront placés en groupe sociaux de quatre individus par cage, dans des cages standards répondant aux normes européennes. Ils bénéfécieront d’un temps d’adaptation avant toute expérimentation et également d’enrichissement dans leur cage (roue d’activité, cartons, craft). Une surveillance étroite des animaux sera effectuée, de leur arrivée à la fin du protocole, par un personnel compétent, afin de déterminer leur état général (mesure du poids, évaluation de l’apparence physique, respiration). Si nécessaire, ce même personnel mettra en place des mesures afin d’améliorer le bien-être animal. La mesure du poids sera faite trois fois par semaine. Les animaux disposeront de croquettes humidifiées dans le fond de leur cage ainsi que de complément alimentaire (DietGel Recovery) afin de limiter et compenser la perte de poids attendue suite aux procédures expérimentales. Les différences procédures ont été pensées de manière à limiter au maximum la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriés ainsi que par le choix de points limites cohérents. A chaque sortie des aniamux de la zone EOPS, une désinfection au phagospray est réalisée sur chaque matériel utilisé avant chaque expérimentation et pour chaque procédure.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Note de l'OXA. Le dossier d'autorisation demande de justifier l'origine des animaux, leur espèce, leur nombre estimé et leur stade de développement (arrêté du 1er février 2013, art. 5). La justification attendue est technique : elle porte sur l'adéquation de l'espèce à l'objectif poursuivi. Ce que l'appartenance à une espèce autorise à faire subir à un individu est une question morale, et le formulaire ne la pose pas. L'appartenance à une espèce, prise seule, ne fonde pourtant pas de différence de statut moral entre des individus également capables de souffrir.
Les modèles tumoraux in vivo sont nécessaires afin d’évaluer l’effet du traitement sur la progression de la tumeur tout en prenant en compte toutes les composantes du microenvironnement tumoral dont les interactions avec les cellules tumorales peuvent biaiser l’effet thérapeutique du traitement. Le développement de xénogreffes de tumeurs humaines nécessite l’utilisation d’individus immunodéficients afin d’éviter tout rejet de greffe. Nous utiliserons donc des souris immunodéprimées NSG. Notre traitement étant constitué de CAR-T, l’absence d’immunité de ces souris évitera les réactions croisées et dirigées contre les CAR-T. Ce modèle permettra donc la croissance de cellules tumorales humaines et la survie des cellules immunitaires humaines, permettant ainsi d’étudier l’effet du traitement sur un modèle de tumeur cérébrale reposant sur l’implantation de cellules de glioblastome d’origine humaine et reflétant l’hétérogénéité moléculaire des GBM observée en clinique. Le choix de la souris NSG est idéal car ce modèle étant déjà maîtrisé dans le laboratoire partenaire, il permettra d’obtenir des résultats fiables et reproductibles. Nous utiliserons des souris mâles et femelles, en lien avec les recommandations actuelles pour mieux représenter la réalité clinique car, si le sexe ratio du GBM est de 1.6 (en faveur des hommes), il touche aussi bien des femmes que des hommes. L’ensemble des animaux utiliés dans cette étude seront de jeunes adultes âgés de 8 semaines en début de protocole. A ce stade, le cerveau est mature et cela permettra le développement de tumeurs plus reproductibles. Il sera possible de suivre l’évolution des animaux sur des temps plus longs.