Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 14/04/2026
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-260579)
Les souris qui perdent 20 % de leur poids ou atteignent un score clinique de 9 sont mises à mort. 30 souris immunodéficientes NSG sont utilisées dans des procédures d’un niveau de souffrance modéré, toutes tuées. Chacune reçoit une injection de cellules souches humaines pour lui reconstruire un système immunitaire humain, puis des prélèvements sanguins rétro-orbitaires toutes les deux semaines, alternés d’un œil à l’autre. Le porteur signale un risque de réaction du greffon contre l’hôte et retient ce modèle pour éviter le recours au sang de cordon.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Les cellules souches pluripotentes induites sont des cellules souches qui ont la capacité, selon les conditions de leur environnement, de s’orienter vers différents types de lignées cellulaires et notamment vers la voie immunitaire. Ce projet a pour objectif d’utiliser ces capacités, afin de recréer un système immunitaire humain chez des souris (= humanisation) immuno-déficientes (sans système immunitaire) à partir de cellules souches pluripotentes provenant de cellules humaines. L’utilisation de ces cellules va permettre de standardiser un protocole pour la création d’un modèle murin humanisé sans recourir à des cellules issues de sang de cordon humain, couramment utilisées pour l’humanisation, d’avoir un stock conséquent de cellules pour l’humanisation et de pouvoir recréer chez la souris un système immunitaire personnalisé (à partir de cellules reprogrammées issues de cellules de patients).
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Pour comprendre le développement du système immunitaire humain et essayer d’analyser son comportement par rapport à différentes situations, beaucoup de travaux ont été effectués in vitro sur différents modèles cellulaires. Mais les modèles in vitro ne permettent pas d’étudier la réponse du système immunitaire humain dans son ensemble notamment dans le cas de la recherche sur les rejets de greffe, l’impact d’un médicament ou autre. C’est pourquoi, pour observer le développement de ces cellules et leurs fonctionnalités, des modèles de souris et de rats humanisés (qui ont un système immunitaire humain) ont été développés. Ces modèles murins humanisés se font aujourd’hui essentiellement par l’injection de cellules issues de sang de cordon ombilicale qui est du matériel cher et précieux dû aux stocks limités. Aussi il est nécessaire souvent d’avoir recours à plusieurs donneurs pour un même protocole pouvant entrainer une variabilité dans les résultats. Ainsi ce projet permettrait d’avoir un modèle de souris humanisé standardisé par des cellules ayant la même origine dans un stade de développement contrôlé. Le stock important permettra également d’en réduire le coût et d’avoir un n plus important pour nos projets. Un autre axe de développement peut être l’étude de maladies génétiques impactant le système immunitaire. Effectivement, des iPSC peuvent être générées à partir de cellules d’un patient touché par une maladie génétique. Alors on pourrait orienter ces cellules vers le stade hématopoïétique avec notre protocole de culture cellulaire et les injecter chez l’animal. Ainsi nous aurions un modèle murin avec un système immunitaire humain comportant la mutation ou le fond génétique spécifique d’une maladie. Par ailleurs, on peut envisager également une modification génétique directement in vitro sur nos iPSC d’individus sains (nos iPSC de travail) afin d’avoir des modèles murins avec des cellules humaines ayant une mutation génétique spécifique.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
L’humanisation des animaux se fera via l’injection en intraveineux de cellules iPSC. Des prélèvements sanguins auront lieu au bout de 3 mois après l’humanisation sur animal endormi au niveau du sinus retro-orbital. Les prélèvements auront lieu toutes les 2 semaines alternativement à l’oeil gauche puis à l’oeil droit jusqu’à la fin du protocole.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Nous utiliserons des souris NSG qui sont des animaux immunodéficients et par ce fait, sont très sensibles aux infections. Pour ce protocole, les souris pourront avoir une douleur localisée et momentanée au niveau du site d’injection de la greffe. Elles pourront ressentir un stress dû aux manipulations et prélèvements répétés (pesée, prélèvement de sang) ainsi qu’à l’irradiation. L’injection des cellules en soi, peut être rejetée ou bien provoquer la maladie du greffon contre l’hôte (GVHD). Ainsi, les souris seront examinées quotidiennement pour évaluer la présence de symptômes.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
A l’issu de la procédure tout les animaux seront mis mort afin de faire des prélèvements
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Beaucoup d’étude sur le système immunitaire ont été réalisées in vitro mais de par sa complexité il est essentiel de l’étudier in vivo dans son ensemble. Et pour cela, un des moyens d’étudier le système immunitaire humain est d’utiliser des modèles murins humanisés, c’est-à-dire, ayant un système immunitaire humain. C’est donc dans ces perspectives d’étude du système immunitaire que nous souhaitons créer ce modèle murin à partir de cellules issues d’iPSC. Mais avant cela, notre laboratoire a réalisé beaucoup d’études uniquement in vitro pour ce projet afin de trouver le bon protocole de culture cellulaire et le passage chez l’animal se fait uniquement avec des cellules dont les propriétés sont celles souhaitées par notre équipe pour le développement du système immun humain chez la souris. Aucun autre test sera réalisé avec des cellules n’ayant pas ces propriétés pour ne pas utiliser d’animaux inutilement.
2. Réduction
L’efficacité de notre modèle de souris humanisées sera étudiée par le biais de tests statistiques. Le nombre d’animaux par groupe a été réduit au nombre nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement analysables et de sorte d’avoir les contrôles suffisants pour pouvoir conclure quant aux résultats obtenus. Ce nombre prend aussi en compte le risque de GVHD et de rejet de greffe. Ce nombre de groupes de souris a été défini par la loi normale. Pour juger de l’efficacité de notre protocole, des prélèvements sanguins seront faits afin d’analyser, via la cytométrie en flux, les différentes populations immunitaires chez les animaux. Afin de comparer les groupes entre eux l’analyse des populations se fera via le test one way RM ANOVA
3. Raffinement
Les souris NSG seront distribuées par 5 maximum par cage avec des moyens d’enrichissement propre à l’espèce (frisottis, dôme et tunnel). Les souris étant immunodéficientes, les cages seront entreposées sur un portoir ventilé et les animaux manipulés sous hottes avec des équipements de protection adaptés pour éviter toute infection. Une surveillance quotidienne des animaux en protocole sera réalisée pour déceler un éventuel problème chez une souris (blessure, forte souffrance non observée auparavant) par les expérimentateurs ou les animaliers. De plus pour déceler les signes éventuels d’une GVHD ou de rejet de greffe, une observation plus attentive sera effectuée une fois par semaine selon une liste de symptômes permettant d’évaluer ces processus avec une grille de score (voir tableau annexe). Le même jour, les animaux seront pesés (pesée une fois par semaine) afin de constater une éventuelle perte de poids. Une souris avec l’un des symptômes suivants : perte de 20% du poids par rapport à J0, un refus d’alimentation, une incapacité de mouvement, une voussure sévère du dos ou une diarrhée sanguinolente, aura atteint un point limite et sera mise à mort. L’atteinte d’un score clinique de 9 points ou plus est également considéré comme un point limite. Les animaux souffrants seront séparés des autres pour leur offrir une facilité d’accès à la nourriture et l’eau. Concernant les injections, un système de contention adapté sera utilisé et une pommade anesthésiante sera appliquée avant l’introduction de la seringue. Après le prélèvement, du collyre à la lidocaïne sera déposé sur les yeux. Un change de litière (minimum 1 fois par semaine) sera réalisé. Un contrôle de l’alimentation et des boissons sera effectué à chaque passage, soit par l’utilisateur, soit par les animaliers. La salle d’hébergement est soumise au rythme jour/nuit et à une isolation efficace afin de limiter les bruits. L’accès à l’animalerie est strictement limité au personnel autorisé. Les personnels habilités à accéder à l’animalerie doivent revêtir une tenue adaptée avec charlotte, masque, sabot et gant.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Nous avons choisi la souris immuno-déficiente pour deux raisons principales : *La souris présente une facilité d’hébergement et de manipulation. *Ces souris immuno-déficientes permettent l’acceptation d’une greffe des cellules immunes humaines. Un tel protocole chez des souris immunocompétentes ne serait pas possible, les cellules humaines seraient rejetées par le système immunitaire murin. Les animaux utilisés auront 5 semaines en début de protocole. C’est l’âge idéale décrit dans la littérature et selon l’expérience de notre laboratoire pour injecter des cellules humaines chez des souris.