Étude de l’effet de l’insufflation intra-abdominale de dioxyde de carbone (CO₂) sur l’inflammation générale et cérébrale dans un modèle d’entérocolite (inflammation sévère de l’intestin) chez la souris

L’entérocolite ulcéro-nécrosante (ECUN) est une maladie grave de l’intestin du nouveau-né prématuré, correspondant à une inflammation sévère pouvant abîmer voire détruire une partie de l’intestin. Elle est responsable d’un état inflammatoire général prolongé avec un risque élevé de complications et de décès (15–30 %). Elle peut également avoir des effets sur le développement cérébral. En effet, elle est associée à une augmentation de la survenue de troubles du neurodéveloppement (TND) sans que l’on ne comprenne encore pourquoi. Les troubles du neurodéveloppement regroupent plusieurs difficultés liées au développement du cerveau pendant l’enfance et peuvent inclure par exemple des difficultés pour apprendre, se concentrer, communiquer ou interagir avec les autres. L’hypothèse principale pour expliquer ces séquelles neurologiques est que l’inflammation due à l’entérocolite perturberait le développement du cerveau chez ces nouveau-nés très fragiles. Le traitement de l’ECUN repose initialement sur les antibiotiques et la mise au repos de l’intestin (mise à jeûn). Si l’intestin se perfore ou si l’état du nouveau-né s’aggrave malgré ce traitement, une opération devient nécessaire. La chirurgie se fait classiquement par laparotomie, c’est-à-dire par une large ouverture abdominale. Une technique plus récente et moins invasive peut être utilisée. Il s’agit de la coelioscopie néonatale. Il s’agit d’une technique chirurgicale peu invasive. Elle consiste à faire de petites incisions dans le ventre pour introduire une caméra et des instruments. Le ventre est légèrement gonflé avec un gaz (le dioxyde de carbone) afin de créer de l’espace et permettre de voir et d’explorer les organes. Seulement 8 % des chirurgiens pédiatres dans le monde utilisent la coelioscopie dans la prise en charge des ECUN. Les études ont montré une diminution significative de l’inflammation chez les nouveau-nés ayant bénéficié d’une coelioscopie. L’hypothèse est l’effet anti-inflammatoire du CO2 insufflé lors de la cœlioscopie et son interaction directe avec l’intestin. Notre projet de recherche a pour objectif d’étudier l’effet anti inflammatoire et notamment neuroprotecteur de l’insufflation intra-abdominale de CO2 sur un modèle d’entérocolite chez la souris. L’intégralité de ce travail aura une application directe sur le protocole de prise en charge chirurgicale des entérocolites des nouveau-nés prématurés, et sur leur pronostic.

Un enfant né prématuré sur trois aura des TND. La survenue de ces troubles est plus fréquente en cas d’ECUN associée. En effet, plus de 50% des nouveau-nés prématurés avec ECUN auront un trouble du neurodéveloppement. Les effets de l’entérocolite sur le cerveau des nouveau-nés n’ont pas encore été élucidés. Avec ce projet, nous cherchons à comprendre d’une part l’association entre TND et entérocolite en étudiant l’impact de l’inflammation sur le développement du cerveau des nouveau-nés. Nous cherchons à comprendre d’autre part la baisse de l’inflammation et la meilleure évolution des nouveau-nés ayant bénéficié d’une coelioscopie, qui ont été constaté chez les patients. Seulement 8 % des chirurgiens pédiatres dans le monde utilisent la coelioscopie dans la prise en charge des ECUN. Les résultats de nos expériences précliniques, s’ils s’avèrent positifs, constitueraient un pré requis indispensable à la généralisation de l’exploration coelioscopique chez les nouveau-nés atteints d’ECUN. L’intégralité de ce travail aura une application directe sur le protocole de prise en charge chirurgicale des ECUN, et sur leur pronostic à court et long terme.

Les animaux seront soumis à quatre types d’intervention : – Une alimentation par une fine sonde orogastrique (fin tube introduit par la bouche, jusqu’à l’estomac) avec une solution lactée matin et soir du 3ème au 7ème jour de vie. La composition de la solution lactée diffère entre les groupes. Certains souriceaux recevront du lait à usage vétérinaire. D’autres souriceaux recevront du lait à usage vétérinaire contenant une substance qui provoque de l’inflammation intestinale (Dextran Sodium Sulfate). Cela permet de reproduire, chez la souris, une entérocolite similaire à celle observée chez les nouveau-nés prématurés. – Un maintien pendant 10 minutes trois fois par jour du 3ème au 7ème jour de vie dans une chambre avec une concentration en oxygène abaissée de 21 à 5%. – Au 6ème jour de vie, certains souriceaux auront une insufflation de CO2 dans l’abdomen, c’est à dire qu’ils recevront une faible quantité de gaz dans la cavité abdominale à l’aide d’un très fin tube. Cette procédure sera réalisée sous anesthésie générale afin que les animaux ne ressentent aucune douleur. Le gaz sera administré pendant 10 minutes avec une pression très faible et contrôlée. Chaque souris concernée recevra cette intervention une seule fois. – Une IRM cérébrale sera réalisée sur chaque souris autour du 40ème jour de vie. Celle-ci sera réalisée sous anesthésie générale pour obtenir une immobilité parfaite.

Les animaux peuvent tout d’abord subir un stress temporaire lors : des manipulations, de la séparation ponctuelle avec la mère chez les souriceaux, des tests comportementaux, et du transport des animaux vers les salles d’expérimentation. Ils peuvent ensuite être sujets aux symptômes d’entérocolite : douleur abdominale, diarrhée, sang dans les selles, altération de l’état général, décès. L’administration du lait par voie orogastrique (sonde introduite par la bouche jusqu’à l’estomac) présente également des risques : l’introduction de cette sonde peut entrainer un stress et un inconfort liés au passage de la sonde et à la contention. Dans de rares cas des complications peuvent survenir, comme une fausse route ou une perforation de l’œsophage. De plus, bien que cela reste exceptionnel, une perforation d’organe suivi du décès peut survenir lors de l’introduction du petit tube d’insufflation de CO2. Pour finir, ils présentent un risque de décès provoqué par les produits anesthésiants lors des procédures réalisées sous anesthésie générale.

Les animaux sont mis à mort à l’issue de la procédure afin de réaliser les prélèvements tissulaires post-mortem : – A l’âge de 8 jours : prélèvement des intestins pour caractériser l’entérocolite, des cerveaux pour analyse de l’architecture cérébrale et des conséquences cérébrales de l’inflammation, du sang, du foie et de la rate pour caractériser l’inflammation. – A l’âge de 50 jours : prélèvement des cerveaux pour caractériser l’architecture cérébrale.

Parmi les modèles animaux d’ECUN, le rongeur est largement utilisé dans la littérature. Plusieurs études sur les conséquences de l’insufflation du CO2 chez la souris ont été publiées précédemment. L’insufflation de CO2 intra-abdominale chez la souris est facilement réalisable, reproductible et ne nécessite qu’un seul point de ponction. Notre modèle d’entérocolite est induit chez des souriceaux du 3ème au 7ème jour de vie car ils ont à cet âge, un développement cérébral comparable à celui d’un nouveau-né prématuré. Les tests comportementaux sont réalisés pendant la période de l’acquisition motrice puis plus tard au 30ème et 45ème jours de vie correspondant aux périodes d’adolescence et de jeune adulte, à la recherche de troubles du neurodéveloppement.