Babouins

Une trentaine d'anesthésies par animal, dix-sept séances d'imagerie, douze lavages broncho-alvéolaires et jusqu'à huit semaines d'hébergement individuel : 60 babouins juvéniles vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Tous reçoivent des candidats vaccins puis sont infectés par la bactérie de la coqueluche, avec une toux qui peut durer de trois à six semaines et des saignements après les écouvillonnages. Le porteur décrit le babouin comme la seule espèce reproduisant les symptômes coquelucheux humains, et retient des juvéniles sevrés pour représenter les réponses immunitaires des enfants. 40 babouins sont tués pour prélever leurs organes, les 20 autres restent vivants et pourront être réutilisés dans de nouveaux projets compatibles avec leur historique.

Objectifs

La coqueluche est une infection bactérienne des voies respiratoires responsable de 40 millions de cas et 300 000 décès par an dans le monde. Chez les patients les plus jeunes, les symptômes caractéristiques (fièvre, toux) peuvent évoluer vers une détresse respiratoire grave, voire entraîner le décès. Cette maladie affecte principalement les nourrissons et les jeunes enfants, dont le système immunitaire n’est pas encore pleinement développé. Depuis les années 1940-1950, des vaccins dits « ancienne génération » ont été développés afin d’immuniser les populations. Néanmoins, à partir des années 1990 et en raison de préoccupations liées aux effets indésirables (comme la fièvre et/ou des réactions inflammatoires au point d’injection), des vaccins « nouvelle génération » sont utilisés. Depuis quelques années, une recrudescence des cas de coqueluche a été observée. Des études épidémiologiques, cliniques et précliniques ont démontré que l’immunité conférée par la vaccination avec les vaccins de nouvelle génération diminue rapidement. Ils protègent contre la maladie, mais pas contre la colonisation bactérienne ni la transmission. Ceci a pour conséquence de permettre la transmission de la bactérie aux jeunes populations encore non protégées. Il apparaît donc nécessaire de développer de nouveaux vaccins capables d’induire une immunité durable, protégeant à la fois contre les symptômes, la colonisation bactérienne et la transmission. Dans ce projet, nous évaluerons l’efficacité de nouveaux candidats vaccins pour prévenir la maladie et la colonisation bactérienne chez des primates non-humains juvéniles, comme modèle des populations humaines pédiatriques à risque.

Bénéfices attendus

Les candidats vaccins qui auront montré des résultats satisfaisants chez le modèle primate non-humain pourront à court terme être utilisés lors d’essais cliniques chez l’être humain adulte. Ils pourront, à moyen-long terme, recevoir une autorisation de mise sur le marché pour être utilisés dans les populations humaines adultes et pédiatriques.

Procédures

Les différentes interventions prévues dans ce projet sont réalisées sous anesthésie générale : - Anesthésie des animaux (31 fois environ, 30 minutes, 60 animaux) - Administration de solutions pour l’immunisation (3 fois environ, 5 minutes, 60 animaux) - Infection par la bactérie (1 fois, 15 minutes, 60 animaux) - Prélèvement de sang (31 fois environ, 5 minutes, 60 animaux) - Ecouvillonnage mucosal (27 fois environ, 1 minute, 60 animaux) - Lavage broncho-alvéolaire (12 fois environ, 10 minutes, 60 animaux) - Implantation d’une puce de suivi (1 fois, 30 minutes, 60 animaux) - Imagerie in vivo (17 fois environ, 45 minutes, 60 animaux) - Examen de mesure des variations de volume pulmonaire (11 fois, 10 minutes, 60 animaux) - Euthanasie (1 fois, au maximum 60 animaux) Hébergement individuel (jusqu’à 8 semaines maximum après exposition bactérienne, 60 animaux)

Impact sur les animaux

Dans ce projet, des nuisances ou effets indésirables pourront être observés selon les interventions : Nuisances liées à la vaccination (peu attendues) : Réaction locale, démangeaisons/douleur dans les heures /jours suivant l’administration. Nuisances liées à l’infection par la bactérie : Fièvre légère transitoire pouvant aller jusqu’à 1 semaine. Ecoulement nasal, toux, toux intense pouvant aller de 3 à 6 semaines. Nuisances liées aux anesthésies et prélèvements de sang : Trouble de l’appétit avec plus ou moins de perte de poids mineure ou absence de prise de poids, anémie transitoire (légère), hématome au niveau du site du prélèvement, jusqu’à une semaine. Nuisances suite aux écouvillonnages : Saignement pouvant aller de quelques secondes à minutes. Nuisances liées aux lavages broncho-alvéolaires : Irritation trachéale liée à l’intubation dans les heures suivant la manipulation. Nuisances liées à l’implantation de puces de télémétrie : Réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie (rare), démangeaisons, durée de 1 à 5 jours. Nuisances liées à l’hébergement individuel : L’hébergement individuel peut entrainer un stress ou de l’ennui. Il sera limité au strict minimum (jusqu’à 8 semaines après l’exposition).

Devenir

40 animaux seront euthanasiés afin de prélever les organes d’intérêt dans le but de réaliser des analyses des tissus. L’accès à ces prélèvements permet d’analyser l’impact de la vaccination ou de l’exposition sur les organes, ce qui ne serait pas possible chez l’être humain. 20 animaux seront gardés en vie et pourront être réutilisés, sur avis vétérinaire, dans de nouveaux projets compatibles avec leur historique afin de réduire le nombre d’animaux naïfs utilisés en recherche.

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, l’utilisation de l’animal de laboratoire est nécessaire pour reproduire ce qui est observé chez l’être humain développant une coqueluche, ainsi que l’immunité induite suite à la vaccination. La caractérisation de la maladie, y compris les impacts sur les organes, et la mise en évidence des vaccins à protéger de la maladie n’est pas réalisable avec les modèles actuels non animaux (cellules, organes, ou modélisation informatique). Bien que ces modèles puissent être utilisés pour répondre à des questions spécifiques, ils ne reproduisent pas encore la complexité du corps humain, comme le fonctionnement des organes ou du système de défense contre les infections, ni les interactions entre ces différents éléments à l’échelle du corps entier. En revanche, le primate non humain est très proche de l’être humain sur le plan biologique. Son utilisation permet donc une transposition rapide des résultats précliniques à la clinique humaine.

Réduction

Le nombre d’animaux dans chaque groupe est réduit au minimum nécessaire. Afin de tester l’efficacité des candidats vaccins, le nombre d’animaux a été établi à 6 animaux par groupe expérimental permettant une analyse statistique valable des résultats obtenus.

Raffinement

Les interventions et prélèvements seront réalisés sous anesthésie générale. Un maximum de prélèvements et interventions seront regroupés lors d’une même anesthésie afin de réduire le nombre d’anesthésies. Les anesthésies pouvant entrainer une diminution de l’appétit, une diversification et complémentation de l’alimentation sera instaurée au besoin. Les animaux seront observés quotidiennement. En cas d’apparition de signes cliniques, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin d’adapter le suivi et les soins aux animaux. Si les points limites définis sont atteints, les animaux seront sortis de l’étude et l’euthanasie pourra être envisagée. Les prélèvements de sang pouvant entrainer l’apparition d’une réaction locale, un traitement symptomatique pourra être mis en place (désinfection, analgésie locale). Pour limiter l’irritation de la trachée liée à l’intubation lors du lavage pulmonaire, un spray anesthésique sera appliqué localement en amont de la manipulation. L’implantation de puces, permettant un suivi régulier de paramètres biologiques, peut induire une réaction au site d’incision. Un signalement au vétérinaire sera effectué qui pourra décider du retrait de la puce et éventuellement de la sortie de l’animal de l’étude et appliquer un traitement symptomatique (désinfection, analgésie locale). Un traitement analgésique est appliqué avant la chirurgie. Les animaux seront hébergés en cages individuelles suite à l’exposition par la bactérie pour empêcher toute surinfection liée à une contamination croisée et le stress lié à la cohabitation d’animaux développant la maladie. Le programme d’enrichissement sera étendu par ajout de dispositifs alimentaires, jouets, renforcement du contact positif. La durée de l’hébergement en cage individuelle sera limitée à 8 semaines au maximum après l’infection.

Choix des espèces

Le babouin a été sélectionné pour ce projet car il est le seul modèle réunissant les éléments nécessaires à l’évaluation de l’infection par l’agent responsable de la coqueluche : c’est la seule espèce animale connue à reproduire les symptômes coquelucheux retrouvés chez l’être humain. Le système immunitaire de cette espèce est proche de celui des humains et les réponses vaccinales induites chez cette espèce sont semblables à celles observées chez l’être humain. C’est donc le seul modèle permettant d’évaluer à la fois l’immunogénicité et l’efficacité de vaccins. Ce projet a pour objectif d’étudier l’efficacité de nouveaux vaccins contre la coqueluche qui seront administrés à terme à des enfants. Ce projet repose donc sur l’utilisation de babouins juvéniles sevrés (>8 mois) comme modèle des réponses immunitaires des populations pédiatriques humaines.

11 babouines vont être capturées et anesthésiées six fois chacune, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trois de ces anesthésies servent à une échographie, un prélèvement de 16 millilitres de sang et une injection de denosumab ou de placebo, une quatrième à l'ablation chirurgicale des deux ovaires, les deux dernières à de nouveaux prélèvements. Le porteur indique que le médicament provoque fréquemment des douleurs ostéoarticulaires chez la femme ménopausée et que la chirurgie expose à des saignements, une infection ou une réouverture de la plaie, suivis de deux à cinq jours d'isolement. Toutes sont gardées vivantes dans leurs groupes sociaux d'origine, le porteur estimant que ces prélèvements "ne sont pas invalidants", après le retrait de leurs deux ovaires.

Objectifs

Dans le squelette, certaines cellules osseuses expriment une protéine "RANKL" qui se lie et active un récepteur spécifique "RANK". Ce système de signalisation RANKL est un régulateur reconnu de la santé osseuse, mais sa présence a été démontrée dans les gonades de souris et d'humains, et les données montrent que c'est un puissant régulateur dans la production de spermatozoïdes et de leur motilité. Récemment, des études ont montré que le système RANKL est également présent et actif dans la fonction reproductrice féminine (souris et humains). Les données chez les femmes qui subissent une fécondation in vitro suggèrent que le système RANKL intervient dans le stade précoce de la folliculogenèse et qu'il est également associé à l'âge (sa concentration son inhibiteur plus faible chez les femmes les plus jeunes que chez les femmes âgées de plus de 40 ans). Sur la base de nos données préliminaires, nous suggérons que la signalisation du RANKL joue deux rôles distincts dans la fonction ovarienne : l'un régulant la réserve folliculaire, l'autre jouant un rôle clé durant les dernières étapes de la maturation ovocytaire. Nous émettons l'hypothèse que la signalisation RANKL joue un rôle essentiel dans la fonction ovarienne en régulant la réserve folliculaire et en modulant la maturation ovocytaire pendant les étapes finales du développement folliculaire. Pour tester cette hypothèse, nous mènerons une étude chez le primate non humain (PNH) afin de découvrir le rôle régulateur de la signalisation RANKL pendant la folliculogenèse et la maturation des ovocytes. Ainsi, l'objectif global de ce projet est de découvrir une nouvelle biologie ovarienne qui pourrait être utilisée pour améliorer la fertilité des femmes infertiles et prolonger la longévité reproductive des femmes.

Bénéfices attendus

L'infertilité est un problème courant, qui touche jusqu'à 15 % des couples dans le monde. Actuellement, la plupart des couples infertiles sont traités par des techniques de procréation assistée. Ce traitement réussit dans 70 % des cas, mais il est coûteux, invasif et associé à de potentiels effets secondaires chez la mère. Nos résultats préliminaires indiquent que le système de signalisation RANKL est présent et actif dans la fonction reproductive féminine, constituant ainsi une nouvelle cible pour le traitement de l'infertilité. Le dénosumab, un inhibiteur du RANKL, est actuellement utilisé pour traiter l'ostéoporose et peut donc avoir une importance clinique immédiate. Cependant, les résultats des études chez la souris contrastent avec les données chez l'Homme ce qui limite l'utilisation de modèles murins pour étudier les effets du traitement par le denosumab sur les résultats reproductifs chez les femmes, d'où la nécessité d'étudier les effets de ce traitement chez les PNH. En raison de leur similarité anatomique et physiologique avec l'humain, les babouins constituent un excellent modèle pour les études sur la reproduction et ont été largement utilisés pour étudier la reproduction chez la femme. Nous avons réalisé une étude pilote au cours de laquelle l'analyse de marqueurs sanguins ont démontré que le babouin était sensible au traitement par le dénosumab. Le projet décrit fournira à court terme des informations précieuses sur les effets du traitement au denosumab sur la fonction reproductive féminine évaluée par les changements hormonaux et de l'ovaire. Lorsque nous traitons des animaux ou des humains in vivo avec un inhibiteur de RANKL tel que le Denosumab, moins de petits follicules meurent et plus de follicules survivent et peuvent être recrutés plus tard dans la vie. Cela implique que les femmes vieillissantes pourraient en bénéficier et que les femmes souffrant d'insuffisance ovarienne pourraient profiter de cette opportunité pour avoir de meilleures chances de réussir le prélèvement d'ovocytes lors d'une FIV.

Procédures

Chaque animal sera capturé et anesthésié SIX fois au cours de l'étude : - 3 courtes anesthésies (20-30 minutes) pour prélèvement sanguin + ECHOGRAPHIE (16 mL) et injection de denosumab ou placebo (T0-T1-T2) - 1 anesthésie de 1 à 2h pour chirurgie (ovariectomie BIlatérale) avec prélèvement sanguin (16mL) (T3) - DEUX courteS anesthésieS (20-30 minutes) pour prélèvement sanguin (16 mL) (T4 et T5)+ ECHOGRAPHIE

Impact sur les animaux

Stress lors de la capture. Anesthésie (dépression cardiorespiratoire, déshydratation, hypotension, hypothermie). Prélèvement sanguin (risque hématome). Effets secondaires du denosumab : douleurs ostéo articulaires ou musculosquelettiques rapportées fréquemment chez la femme ménopausée sous traitement chronique, de manière moins fréquente infection du tractus urinaire ou respiratoire, constipation, gêne abdominale ou éruption cutanée (aucun effet secondaire rapporté chez le macaque cynomolgus à 8 fois la dose administrée). Complications chirurgicales : saignements, hémorragies, infection de plaie ou déhiscence. Isolement de 2 à 5 jours en post opératoire (ennui, stress).

Devenir

Tous les femelles seront gardées en vie et dans leurs groupes sociaux d’origine car les prélèvements prévus ne sont pas invalidants.

Remplacement

Récemment, des études ont montré que le système étudié est présent et actif dans les gonades femelles de souris et humains. Cependant, ces études in vitro ont des limites, car l'administration de denosumab a des effets systémiques qui doivent être évalués in vivo. Ce protocole vise à étudier les effets du denosumab qui est un médicament qui agit sur différents organes par des effets systémiques. Ce projet est donc une étape ultérieure à ces analyse in vitro et qui est nécessaire pour étudier les effets du denosumab sur la résorption osseuse et la reproduction féminine. Pour étudier de tels effets systémiques et hormonaux, une étude in vivo est obligatoire et dans ce contexte, il est impossible de remplacer l’utilisation d’animaux vivants par des méthodes alternatives.

Réduction

Avant la mise en place de cette étude, une étude pilote a été réalisée pour s'assurer que les babouins sont sensibles au denosumab, et donc que les babouins sont des modèles animaux valables pour le traitement. Le nombre minimal d'animaux nécessaire pour obtenir des données fiables a été choisi afin de minimiser le nombre d'animaux utilisés. Le calcul de la puissance est basé sur une étude pilote menée sur un seul babouin, où le taux sanguin d'une hormone a augmenté de 40 %. Avec un niveau de test de 5 % (niveau de signification) et une puissance de 80 %, 5 babouins femelles dans chaque groupe à chaque point dans le temps seront suffisants pour atteindre une signification statistique. L'effet sur la folliculogenèse nécessitera également une comparaison entre le placebo et le traitement au denosumab. 4 à 5 animaux dans chaque groupe sont normalement utilisés pour effectuer une telle analyse, ce qui justifie la taille de l'échantillon. Pour réduire le nombre d'animaux, chaque babouin injecté servira également de contrôle interne. L'effet du denosumab sera examiné en comparant les échantillons sanguins de base avec ceux prélevés après l'injection.

Raffinement

Concernant la capture, elle est toujours réalisée en privilégiant une méthode sans contention (ni chimique, ni physique). Elle consiste d’abord à isoler l’animal lors de son passage dans le tunnel de son hébergement. Une fois isolé dans le tunnel, l’animal est transféré dans une boite de transport accolée au tunnel puis transféré dans une zone d’isolement temporaire avec une cage à fond amovible. Tous les prélèvements sont réalisés sous anesthésie injectable. Pendant toute l’anesthésie les individus seront surveillés et monitorés par les vétérinaires (i.e. ECG, Fréquence Cardiaque, Fréquence Respiratoire, Température rectale). Suite aux anesthésies, les femelles seront réveillées dans leurs loges d’origine et réintroduites dans leurs groupes dès qu’elles sont suffisament réveillées, selon la procédure validée par la SBEA. Pour l’ovariectomie (T3), l'intervention a lieu sous anesthésie ) et sous analgésie (anti inflammatoires et morphiniques). L’animal sera isolé la veille de l’intervention de son groupe pour assurer la mise à jeûn, puis restera en infirmerie pendant 2 à 5 jours en post opératoire sous traitement antalgique. Il sera alors suivi avec une grille de score et de douleur spécifique et disposera d’un planning d’enrichissement dédié avec 4 enrichissements manipulatoires ou alimentaires journaliers. Après validation de sa récupération et de son état de santé par l’équipe vétérinaire il sera réintroduit dans son groupe d’origine, en accord avec les procédures validées par la SBEA et sous surveillance de l’équipe BEA.

Choix des espèces

Les résultats des études chez la souris contrastent avec les données chez l'être humain et le schéma d'expression du système de signalisation RANKL chez la souris ne reflète pas celui de l'être humain. Cela limite l'utilisation de modèles murins pour étudier les effets du traitement par le denosumab sur les résultats reproductifs chez les femmes, d'où la nécessité d'étudier les effets de ce traitement chez les primates non humains. En raison de leur similarité anatomique et physiologique avec l'homme, les babouins constituent un excellent modèle pour les études sur la reproduction et ont été largement utilisés pour étudier la reproduction chez la femme. Un autre avantage est qu'il est facile de suivre le stade du cycle œstral chez le babouin car il peut être distingué visuellement chez les babouins femelles par des modifications anatomiques de la région périnéale (gonflement et règles). Les animaux inclus seront tous des babouins femelles d'un âge avancé (15-25 ans), mais non ménopausées. En effet, ces animaux seront plus sensibles aux traitements affectant les résultats reproductifs que les jeunes animaux très fertiles, ce qui est important si nous voulons utiliser le médicament pour le traitement de l'ovaire vieillissant chez les femmes.

Gardés en vie pour être réintroduits plus tard dans d'autres protocoles, 50 porcs, 25 macaques à longue queue et 25 babouins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les expérimentateurs leur prélèvent sous anesthésie salive, cellules de joue, sang ou moelle osseuse, cette dernière ponction pouvant provoquer une douleur au point de piqûre et imposant au moins quatre semaines de récupération. Aucune question scientifique propre n'est posée ici. Ces prélèvements alimentent des tests in vitro préalables, destinés à décider si telle ou telle espèce sera utilisée ensuite, et le porteur affirme qu'il n'existe "pas de remplacement possible" pour obtenir ces échantillons.

Objectifs

Cette demande correspond à un autorisation de prélèvements d’échantillons biologiques en dehors et/ou en amont de projet autorisés. Effectivement, il est parfois nécessaire de réaliser en dehors et/ou en amont de protocoles autorisés des prélèvements biologiques de petits ou moyens volumes/quantité (sang, moelle osseuse, salive, cellules buccales par exemple …) pour permettre la réalisation de test in vitro préalable à une étude.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ces prélèvements sont de pouvoir étudier et évaluer in vitro certains paramètres liés à ces espèces. Ces résultats préliminaires établis in vitro en amont des protocoles d’expérimentation animale permettent de définir, de cibler et d’affiner l’intérêt et la rationalité d’utiliser ou non telle ou telle espèce, et potentiellement de réduire le nombre d’animaux utilisés dans une démarche de respect de la règle des 3R.

Procédures

Prélèvements sous anesthésie : salive par aspiration (5 min), prélèvement de cellules de bas-joues par frottement (5 min), de sang (5 min) ou de moelle osseuse (15 min). Prélèvement unitaire suivi d’une période de récupération pour chaque individu.

Impact sur les animaux

Les prélèvements biologiques sont réalisés sous anesthésie de façon à atténuer le stress des animaux. Les prélèvements de salives, cellules buccales et de sang sont des prélèvements peu invasifs qui peuvent induire de l’inconfort. Les prélèvements de sang nécessitent un temps de récupération selon le volume prélevé. Le prélèvement de moelle osseuse peut induire une douleur au point de ponction et sera associée à une analgésie. Il nécessite un temps de récupération d’au moins 4 semaines après le prélèvement.

Devenir

Les animaux seront gardés en vie et pourront être introduits ultérieurement dans un autre projet expérimental dans le cadre d'une procédure légère ou modérée, après décision du vétérinaire.

Remplacement

Il n’existe pas de remplacement possible pour l’obtention d’échantillons biologiques intrinsèques aux animaux pour tests in vitro. Ces prélèvements répondent cependant aux exigences de réduction et de raffinement.

Réduction

Cette autorisation correspond à des besoins ponctuels d’échantillons biologiques chez des animaux en dehors et/ou en amont de protocoles, c’est pourquoi aucune approche statistique n’est envisagée. Cependant les animaux concernés par cette autorisation, en première utilisation ou en réutilisation après un protocole antérieur, seront inclus ultérieurement dans différents projets d’études expérimentales pré-cliniques autorisés, selon décision du vétérinaire, ce qui contribue à une réduction du nombre d’animaux utilisés à moyen terme.

Raffinement

De façon à diminuer le stress et l’inconfort des animaux, les prélèvements seront réalisés sous anesthésie, sur tapis chauffant. Le volume des prélèvements sanguins sera limité à la volémie de chaque individu. Leur fréquence sera limitée au temps de récupération par rapport au volume précédemment prélevé. Cependant, dans la grande majorité des cas, les volumes de sang prélevés seront largement inférieurs aux limites. Le prélèvement de moelle osseuse sera accompagné d’un traitement analgésique. De façon à diminuer les interventions et si les besoins scientifiques de mise au point le nécessitent, plusieurs prélèvements pourront être réalisés en même temps sur un même individu à conditions qu’ils n’altèrent pas la récupération de l’individu. De façon à s'assurer du bien-être des animaux prélevés, les points limites mis en place seront observés et appliqués si besoin. Les primates sont hébergés en volière de façon à respecter leur mode de vie en communauté. Les porcs, selon leur taille, sont hébergés par 2 ou 3 par boxes, au sein d’une même pièce. L’ensemble des animaux sera soumis une surveillance quotidienne.

Choix des espèces

Les prélèvements échantillons biologiques de macaques, babouins et porcs, sont nécessaires à la connaissance de plusieurs paramètres en amont d’évaluation précliniques. Ces animaux présentent des similitudes au niveau anatomique, physiologique, métabolique et immunologique avec l’homme. Il s’agit de jeunes adultes et adultes correspondant aux animaux utilisés dans notre établissement selon l’objectif des projets.

Chaque femelle babouin est capturée et anesthésiée cinq fois, pour cinq prises de sang de 16 mL, des injections de denosumab ou de placebo, et l'ablation chirurgicale d'un ovaire suivie de deux à cinq jours d'isolement en infirmerie. 10 babouins femelles âgées de 15 à 25 ans vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour mesurer l'effet sur la fertilité d'un médicament contre l'ostéoporose. Le calcul d'effectif repose sur une étude pilote menée sur un seul babouin. Le porteur justifie leur maintien en vie par des prélèvements "pas invalidants", alors que l'une des cinq interventions retire un ovaire à des femelles étudiées pour leur fonction reproductive. Toutes retournent dans leurs groupes sociaux d'origine, et le champ structuré les compte comme réutilisées.

Objectifs

Dans le squelette, certaines cellules osseuses expriment une protéine "RANKL" qui se lie et active un récepteur spécifique "RANK". Ce système de signalisation RANKL est un régulateur reconnu de la santé osseuse, mais sa présence a été démontrée dans les gonades de souris et d'humains, et les données montrent que c'est un puissant régulateur dans la production de spermatozoïdes et de leur motilité. Récemment, des études ont montré que le système RANKL est également présent et actif dans la fonction reproductrice féminine (souris et humains). Les données chez les femmes qui subissent une fécondation in vitro suggèrent que le système RANKL intervient dans le stade précoce de la folliculogenèse et qu'il est également associé à l'âge (sa concentration son inhibiteur plus faible chez les femmes les plus jeunes que chez les femmes âgées de plus de 40 ans). Sur la base de nos données préliminaires, nous suggérons que la signalisation du RANKL joue deux rôles distincts dans la fonction ovarienne : l'un régulant la réserve folliculaire, l'autre jouant un rôle clé durant les dernières étapes de la maturation ovocytaire. Nous émettons l'hypothèse que la signalisation RANKL joue un rôle essentiel dans la fonction ovarienne en régulant la réserve folliculaire et en modulant la maturation ovocytaire pendant les étapes finales du développement folliculaire. Pour tester cette hypothèse, nous mènerons une étude chez le primate non humain (PNH) afin de découvrir le rôle régulateur de la signalisation RANKL pendant la folliculogenèse et la maturation des ovocytes. Ainsi, l'objectif global de ce projet est de découvrir une nouvelle biologie ovarienne qui pourrait être utilisée pour améliorer la fertilité des femmes infertiles et prolonger la longévité reproductive des femmes.

Bénéfices attendus

L'infertilité est un problème courant, qui touche jusqu'à 15 % des couples dans le monde. Actuellement, la plupart des couples infertiles sont traités par des techniques de procréation assistée. Ce traitement réussit dans 70 % des cas, mais il est coûteux, invasif et associé à de potentiels effets secondaires chez la mère. Nos résultats préliminaires indiquent que le système de signalisation RANKL est présent et actif dans la fonction reproductive féminine, constituant ainsi une nouvelle cible pour le traitement de l'infertilité. Le dénosumab, un inhibiteur du RANKL, est actuellement utilisé pour traiter l'ostéoporose et peut donc avoir une importance clinique immédiate. Cependant, les résultats des études chez la souris contrastent avec les données chez l'Homme ce qui limite l'utilisation de modèles murins pour étudier les effets du traitement par le denosumab sur les résultats reproductifs chez les femmes, d'où la nécessité d'étudier les effets de ce traitement chez les PNH. En raison de leur similarité anatomique et physiologique avec l'humain, les babouins constituent un excellent modèle pour les études sur la reproduction et ont été largement utilisés pour étudier la reproduction chez la femme. Nous avons réalisé une étude pilote au cours de laquelle l'analyse de marqueurs sanguins ont démontré que le babouin était sensible au traitement par le dénosumab. Le projet décrit fournira à court terme des informations précieuses sur les effets du traitement au denosumab sur la fonction reproductive féminine évaluée par les changements hormonaux et de l'ovaire. Lorsque nous traitons des animaux ou des humains in vivo avec un inhibiteur de RANKL tel que le Denosumab, moins de petits follicules meurent et plus de follicules survivent et peuvent être recrutés plus tard dans la vie. Cela implique que les femmes vieillissantes pourraient en bénéficier et que les femmes souffrant d'insuffisance ovarienne pourraient profiter de cette opportunité pour avoir de meilleures chances de réussir le prélèvement d'ovocytes lors d'une FIV.

Procédures

Chaque animal sera capturé et anesthésié 5 fois au cours de l'étude : - 3 courtes anesthésies (20-30 minutes) pour prélèvement sanguin (16 mL) et injection de denosumab ou placebo (T0-T1-T2) - 1 anesthésie de 1 à 2h pour chirurgie (ovariectomie unilatérale) avec prélèvement sanguin (16mL) (T3) - 1 courte anesthésie (20-30 minutes) pour prélèvement sanguin (16 mL) (T4)

Impact sur les animaux

Stress lors de la capture. Anesthésie (dépression cardiorespiratoire, déshydratation, hypotension, hypothermie). Prélèvement sanguin (risque hématome). Effets secondaires du denosumab : douleurs ostéo articulaires ou musculosquelettiques rapportées fréquemment chez la femme ménopausée sous traitement chronique, de manière moins fréquente infection du tractus urinaire ou respiratoire, constipation, gêne abdominale ou éruption cutanée (aucun effet secondaire rapporté chez le macaque cynomolgus à 8 fois la dose administrée). Complications chirurgicales : saignements, hémorragies, infection de plaie ou déhiscence. Isolement de 2 à 5 jours en post opératoire (ennui, stress).

Devenir

Tous les femelles seront gardées en vie et dans leurs groupes sociaux d’origine car les prélèvements prévus ne sont pas invalidants.

Remplacement

Récemment, des études ont montré que le système étudié est présent et actif dans les gonades femelles de souris et humains. Cependant, ces études in vitro ont des limites, car l'administration de denosumab a des effets systémiques qui doivent être évalués in vivo. Ce protocole vise à étudier les effets du denosumab qui est un médicament qui agit sur différents organes par des effets systémiques. Ce projet est donc une étape ultérieure à ces analyse in vitro et qui est nécessaire pour étudier les effets du denosumab sur la résorption osseuse et la reproduction féminine. Pour étudier de tels effets systémiques et hormonaux, une étude in vivo est obligatoire et dans ce contexte, il est impossible de remplacer l’utilisation d’animaux vivants par des méthodes alternatives.

Réduction

Avant la mise en place de cette étude, une étude pilote a été réalisée pour s'assurer que les babouins sont sensibles au denosumab, et donc que les babouins sont des modèles animaux valables pour le traitement. Le nombre minimal d'animaux nécessaire pour obtenir des données fiables a été choisi afin de minimiser le nombre d'animaux utilisés. Le calcul de la puissance est basé sur une étude pilote menée sur un seul babouin, où le taux sanguin d'une hormone a augmenté de 40 %. Avec un niveau de test de 5 % (niveau de signification) et une puissance de 80 %, 5 babouins femelles dans chaque groupe à chaque point dans le temps seront suffisants pour atteindre une signification statistique. L'effet sur la folliculogenèse nécessitera également une comparaison entre le placebo et le traitement au denosumab. 4 à 5 animaux dans chaque groupe sont normalement utilisés pour effectuer une telle analyse, ce qui justifie la taille de l'échantillon. Pour réduire le nombre d'animaux, chaque babouin injecté servira également de contrôle interne. L'effet du denosumab sera examiné en comparant les échantillons sanguins de base avec ceux prélevés après l'injection.

Raffinement

Concernant la capture, elle est toujours réalisée en privilégiant une méthode sans contention (ni chimique, ni physique). Elle consiste d’abord à isoler l’animal lors de son passage dans le tunnel de son hébergement. Une fois isolé dans le tunnel, l’animal est transféré dans une boite de transport accolée au tunnel puis transféré dans une zone d’isolement temporaire avec une cage à fond amovible. Tous les prélèvements sont réalisés sous anesthésie injectable. Pendant toute l’anesthésie les individus seront surveillés et monitorés par les vétérinaires (i.e. ECG, Fréquence Cardiaque, Fréquence Respiratoire, Température rectale). Suite aux anesthésies, les femelles seront réveillées dans leurs loges d’origine et réintroduites dans leurs groupes dès qu’elles sont suffisament réveillées, selon la procédure validée par la SBEA. Pour l’ovariectomie (T3), l'intervention a lieu sous anesthésie ) et sous analgésie (anti inflammatoires et morphiniques). L’animal sera isolé la veille de l’intervention de son groupe pour assurer la mise à jeûn, puis restera en infirmerie pendant 2 à 5 jours en post opératoire sous traitement antalgique. Il sera alors suivi avec une grille de score et de douleur spécifique et disposera d’un planning d’enrichissement dédié avec 4 enrichissements manipulatoires ou alimentaires journaliers. Après validation de sa récupération et de son état de santé par l’équipe vétérinaire il sera réintroduit dans son groupe d’origine, en accord avec les procédures validées par la SBEA et sous surveillance de l’équipe BEA.

Choix des espèces

Les résultats des études chez la souris contrastent avec les données chez l'être humain et le schéma d'expression du système de signalisation RANKL chez la souris ne reflète pas celui de l'être humain. Cela limite l'utilisation de modèles murins pour étudier les effets du traitement par le denosumab sur les résultats reproductifs chez les femmes, d'où la nécessité d'étudier les effets de ce traitement chez les primates non humains. En raison de leur similarité anatomique et physiologique avec l'homme, les babouins constituent un excellent modèle pour les études sur la reproduction et ont été largement utilisés pour étudier la reproduction chez la femme. Un autre avantage est qu'il est facile de suivre le stade du cycle œstral chez le babouin car il peut être distingué visuellement chez les babouins femelles par des modifications anatomiques de la région périnéale (gonflement et règles). Les animaux inclus seront tous des babouins femelles d'un âge avancé (15-25 ans), mais non ménopausées. En effet, ces animaux seront plus sensibles aux traitements affectant les résultats reproductifs que les jeunes animaux très fertiles, ce qui est important si nous voulons utiliser le médicament pour le traitement de l'ovaire vieillissant chez les femmes.

48 babouins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chaque femelle retenue passant dix fois deux heures sous anesthésie, intubée et sous myorelaxant, à raison d'une acquisition IRM par semaine pendant dix semaines. Vingt-quatre femelles gestantes sont d'abord anesthésiées pour dater leur gestation, avec un prélèvement de 12 mL de sang. Aucune n'est tuée, elles sont sorties de leur groupe social le temps des acquisitions puis réintroduites, et pourront être réutilisées dans d'autres projets. Le porteur écrit que la loi française interdit d'acquérir des images IRM sur une femme enceinte sans justification médicale, encore moins de façon répétée pendant plus de dix semaines, et applique précisément ce protocole à des babouines gestantes.

Objectifs

Ce projet inter-disciplinaire rassemble des spécialistes en anatomie corticale, analyse de données, physique de l'IRM, primates-non-humains, neuroradiologie foetale, et anesthésie. Il doit etre effectué sur 2 EUs. Le sujet est l'étude du développement cortical pré-natal en utilisant l'imagerie par résonance magnétique (IRM). Notre objectif est de construire et partager une base de données longitudinale d’images du cerveau foetal en développement chez des primates non-humains (babouins, Papio Anubis), avec une très bonne résolution temporelle. Cette base de données unique en son genre permettra d’observer le cerveau en développement à raison d’une image IRM par semaine entre les 14eme et 24eme semaines de gestation, période pendant laquelle le plissement cortical se forme et change de manière très importante. Aucune base de données de ce type n’existe à l’heure actuelle, alors qu'une telle ressource est cruciale pour l’étude et la compréhension du développement cérébral pré-natal et des pathologies associées. La base de données constituée sera mise à disposition librement auprès de la communauté de neuro-imagerie. Une étude pilote a déjà été effectuée en 2019, approuvée par le comité d'éthique local, et a permis de démontrer la faisabilité du projet et d’en préparer la réalisation en développant et optimisant les aspects les plus critiques de telles acquisitions IRM : anesthésie, prise en charge des animaux, séquences d’acquisition, et pré-traitement des données. Une saisine déposée en 2020 pour 4 ans a permis l'acquisition de 2 sujets après le pilote, il s’agit maintenant de mettre en oeuvre notre démarche expérimentale sur 8 femelles gestantes afin de constituer une vraie base de données. Nous réaliserons 10 acquisitions avec une semaine d’intervalle entres chacune d’entre elles, sur chacune des dix femelles (et donc leur foetus). Le pilote a permis d'optimiser et calibrer 3 éléments : le protocole d’anesthésie, maintenant la mère dans des conditions physiologiques stables et sans neuro-toxicité pour le foetus ; les séquences d’acquisition IRM, pour imager de manière optimale un volume d’intérêt très petit dans des conditions difficiles; et la reconstruction des données, spécifique à ce genre d'acquisitions. Ce projet innovant et difficile à réaliser aura des conséquences à court et à long terme sur l’imagerie foetale clinique, la compréhension du développement cérébral, et les pathologies neurologiques associées.

Bénéfices attendus

Les mécanismes sous-tendant le développement cérébral humain restent encore trop largement inconnus. En particulier, la gyrification, c’est-à-dire la manière dont le cortex cérébral se plisse pendant le développement in-utero, et ses liens avec la connectivité cérébrale, ne sont pas encore compris. Pourtant, la gyrification est un marqueur important du développement et des défauts de gyrification sont associés avec nombre de pathologies neurodéveloppementales ou de pathologies neuropsychiatriques. Comprendre et caractériser le développement in-utero permettra donc d’améliorer la compréhension de ces pathologies, et parfois de permettre leur détection précoce pour une prise en charge le plus tôt possible.

Procédures

Pour chaque femelle : anesthésie pour la datation de la gestation (EU2) avec prélèvement sanguin de 12 mL (1h d'anesthésie maximale) . Une fois pour chacune des 24 femelles au maximum. Pour les femelles incluses dans l'acquisition de données IRM : transport (EU2, durée de 1h à 1h30), séparation du groupe social (EU2), puis dans l'EU1: anesthésie, intubation / ventilation, mise sous myorelaxant, et acquisition IRM pour une durée totale de deux heures. 10 fois (une fois par semaine pendant 10 semaines). Reintroduction dans le groupe social (EU2).

Impact sur les animaux

Stress lors des captures. Transport (entre 1h et 1h30). Anesthésies. Risque d’avortement lié au stress et aux anesthésies. Nuisances liées au prélèvement sanguin.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les sujets n'ont pas besoin d'être mis à mort pour les objectifs scientifiques du projet et seront maintenus en vie. Ils seront donc replacés dans leurs groupes sociaux respectifs. Ils pourront potentiellement être réutilisés dans d'autres projets en prenant en compte l'effet cumulatif.

Remplacement

La législation française ne permet pas d’acquérir de données IRM sur une femme enceinte sans justification médicale, encore moins de manière répétée pendant plus de dix semaines. Cependant, proximité phylogénétique entre primates non-humains et humains, modèles développementaux existants, et connaissances en anatomie comparée, permettent d’affirmer qu’observer le cortex d’un primate non-humain gyrifié (dont le cortex est plissé) permettra d’inférer des informations extrapolables à l’humain.

Réduction

Pour chacune des femelles, 10 images seront acquises pour observer le cerveau du foetus longitudinalement pendant 10 semaines consécutives. Nous disposons déjà de données pour 2 femelles. Nous en incluons donc 8 pour obtenir une base de données de 100 images. La variabilité inter- sujets chez l’humain est telle qu’on estime qu’il faut au moins 50 sujets pour la caractériser. Cette variabilité est plus limitée chez le babouin, nous avons réduit le nombre de sujets à 10, un minimum pour observer des motifs de plissement variables et être capables de produire des statistiques descriptives suffisamment robustes et généralisables. Pour acquérir des données avec 8 femelles et leur foetus, nous sommes amenés à prévoir 12 femelles et leur foetus pour anticiper des exclusions portentielles, et donc à procéder à une datation de gestation sur 24 femelles et leur foetus pour garantir d'en retenir 12.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans l'EU2 dans les zones d’hébergement expérimentales (en dehors de leurs groupes sociaux d’origine) avec au moins un congénère. Cette décision est une mesure de raffinement car la capture à répétition du même individu dans son groupe d’origine implique la manipulation de tous ses congénères ce qui induit un stress supplémentaire pour eux ainsi qu’une augmentation significative du temps de capture de l’animal. Tous les animaux feront partie d’un programme d’enrichissement lié au nourrissage quotidien impliquant au moins 4 moments par jour avec accès à fruits, légumes et graines, ainsi qu’au moins deux enrichissements à manipuler par jour. Tous les animaux font l’objet d’un suivi quotidien par l'équipe de zootechnie et vétérinaire selon les procédures mises en place par la Structure du bien-être animal de l'EU2. Lors de la capture et transfert hebdomadaire de l'EU2 à l'EU1, une méthode sans contention est privilégiée, consistant d’abord à isoler l’animal et le transférer dans une boite de transport accolée à la cage d’hébergement pour remise en cage de transport. Pendant le transport, les animaux sont maintenus dans le noir (effet calmant) par un cache sur la cage de transport. Le compartiment du véhicule agrée est climatisé si besoin. Chaque animal (mère) sera mis à jeun 12 heures avant l’anesthésie avec le maintien d’un accès à de l’eau (sucrée) tel que le prévoient les procédures de routine de l'EU2. Les acquisitions IRM sont réalisées sous anesthésie, pendant lesquelles les animauxseront surveillés et monitorés. Chaque anesthésie devrait durer entre 1h30 et 2h30 maximum. A l'issue de la dernière acquisition, la femelle et son congénère seront réintroduits dans leur groupe social d'origine. La femelle sera alors surveillée quotidiennement jusqu'à la mise bas. Une fois le bébé né, celui-ci sera surveillé quotidiennement par l'équipe de zootechnie et vétérinaire pendant 6 mois, pour s’assurer de son développement normal.

Choix des espèces

Parmi les espèces sur lesquelles une expérimentation est possible, les babouins sont l’espèce phylogénétiquement la plus proche de l’humain et celle offrant l’indice de gyrification le plus proche de l’humain (la gyrification étant le phénomène qui nous intéresse ici). Il s’agit aussi de l’espèce la plus grosse que nous puissions utiliser dans une IRM, ce qui est critique pour faire des acquisitions sur un cerveau de foetus, donc de très petite taille. Femelles gestantes et foetus entre la 8eme et la 24eme semaine de gestation. La 10ème semaine est celle à laquelle la datation de gestation par échographioe sera faite. Puis pour les foetus inclus, il seront scannés par IRM entre la 14eme et la 24eme semaine de gestation. Cet intervalle de gestation correspond à la période pendant laquelle la gyrification du cortex se met en place. Les 3 dernières semaines de gestation (25-27.5) ne peuvent être utilisées car le déplacement des femelles représente un risque d'avortement spontané.

48 babouins sont comptés dans ce projet, 24 femelles gestantes et leurs fœtus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Aucun n'est tué : les mères sont replacées dans leur groupe social et pourront être réutilisées dans d'autres projets. Chaque femelle retenue est capturée puis séparée de son groupe, transportée une heure à une heure trente vers un second établissement, anesthésiée, intubée, ventilée, mise sous myorelaxant et maintenue deux heures dans un aimant d'IRM, dix fois de suite à une semaine d'intervalle, le porteur reconnaissant un risque d'avortement lié au stress et aux anesthésies. Il écrit que la loi française interdit d'acquérir des images IRM chez une femme enceinte sans justification médicale, "encore moins de manière répétée pendant plus de dix semaines", et fonde sur cette interdiction le recours au babouin, l'espèce disponible dont le cortex se plisse le plus comme celui de l'humain.

Objectifs

Ce projet inter-disciplinaire rassemble des spécialistes en anatomie corticale, analyse de données, physique de l'IRM, primates-non-humains, neuroradiologie foetale, et anesthésie. Il doit etre effectué sur 2 EUs. Le sujet est l'étude du développement cortical pré-natal en utilisant l'imagerie par résonance magnétique (IRM). Notre objectif est de construire et partager une base de données longitudinale d’images du cerveau foetal en développement chez des primates non-humains (babouins, Papio Anubis), avec une très bonne résolution temporelle. Cette base de données unique en son genre permettra d’observer le cerveau en développement à raison d’une image IRM par semaine entre les 14eme et 24eme semaines de gestation, période pendant laquelle le plissement cortical se forme et change de manière très importante. Aucune base de données de ce type n’existe à l’heure actuelle, alors qu'une telle ressource est cruciale pour l’étude et la compréhension du développement cérébral pré-natal et des pathologies associées. La base de données constituée sera mise à disposition librement auprès de la communauté de neuro-imagerie. Une étude pilote a déjà été effectuée en 2019, approuvée par le comité d'éthique local, et a permis de démontrer la faisabilité du projet et d’en préparer la réalisation en développant et optimisant les aspects les plus critiques de telles acquisitions IRM : anesthésie, prise en charge des animaux, séquences d’acquisition, et pré-traitement des données. Une saisine déposée en 2020 pour 4 ans a permis l'acquisition de 2 sujets après le pilote, il s’agit maintenant de mettre en oeuvre notre démarche expérimentale sur 8 femelles gestantes afin de constituer une vraie base de données. Nous réaliserons 10 acquisitions avec une semaine d’intervalle entres chacune d’entre elles, sur chacune des dix femelles (et donc leur foetus). Le pilote a permis d'optimiser et calibrer 3 éléments : le protocole d’anesthésie, maintenant la mère dans des conditions physiologiques stables et sans neuro-toxicité pour le foetus ; les séquences d’acquisition IRM, pour imager de manière optimale un volume d’intérêt très petit dans des conditions difficiles; et la reconstruction des données, spécifique à ce genre d'acquisitions. Ce projet innovant et difficile à réaliser aura des conséquences à court et à long terme sur l’imagerie foetale clinique, la compréhension du développement cérébral, et les pathologies neurologiques associées.

Bénéfices attendus

Les mécanismes sous-tendant le développement cérébral humain restent encore trop largement inconnus. En particulier, la gyrification, c’est-à-dire la manière dont le cortex cérébral se plisse pendant le développement in-utero, et ses liens avec la connectivité cérébrale, ne sont pas encore compris. Pourtant, la gyrification est un marqueur important du développement et des défauts de gyrification sont associés avec nombre de pathologies neurodéveloppementales ou de pathologies neuropsychiatriques. Comprendre et caractériser le développement in-utero permettra donc d’améliorer la compréhension de ces pathologies, et parfois de permettre leur détection précoce pour une prise en charge le plus tôt possible.

Procédures

Pour chaque femelle : anesthésie pour la datation de la gestation (EU2) avec prélèvement sanguin de 12 mL (1h d'anesthésie maximale) . Une fois pour chacune des 24 femelles au maximum. Pour les femelles incluses dans l'acquisition de données IRM : transport (EU2, durée de 1h à 1h30), séparation du groupe social (EU2), puis dans l'EU1: anesthésie, intubation / ventilation, mise sous myorelaxant, et acquisition IRM pour une durée totale de deux heures. 10 fois (une fois par semaine pendant 10 semaines). Reintroduction dans le groupe social (EU2).

Impact sur les animaux

Stress lors des captures. Transport (entre 1h et 1h30). Anesthésies. Risque d’avortement lié au stress et aux anesthésies. Nuisances liées au prélèvement sanguin.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les sujets n'ont pas besoin d'être mis à mort pour les objectifs scientifiques du projet et seront maintenus en vie. Ils seront donc replacés dans leurs groupes sociaux respectifs. Ils pourront potentiellement être réutilisés dans d'autres projets en prenant en compte l'effet cumulatif.

Remplacement

La législation française ne permet pas d’acquérir de données IRM sur une femme enceinte sans justification médicale, encore moins de manière répétée pendant plus de dix semaines. Cependant, proximité phylogénétique entre primates non-humains et humains, modèles développementaux existants, et connaissances en anatomie comparée, permettent d’affirmer qu’observer le cortex d’un primate non-humain gyrifié (dont le cortex est plissé) permettra d’inférer des informations extrapolables à l’humain.

Réduction

Pour chacune des femelles, 10 images seront acquises pour observer le cerveau du foetus longitudinalement pendant 10 semaines consécutives. Nous disposons déjà de données pour 2 femelles. Nous en incluons donc 8 pour obtenir une base de données de 100 images. La variabilité inter- sujets chez l’humain est telle qu’on estime qu’il faut au moins 50 sujets pour la caractériser. Cette variabilité est plus limitée chez le babouin, nous avons réduit le nombre de sujets à 10, un minimum pour observer des motifs de plissement variables et être capables de produire des statistiques descriptives suffisamment robustes et généralisables. Pour acquérir des données avec 8 femelles et leur foetus, nous sommes amenés à prévoir 12 femelles et leur foetus pour anticiper des exclusions portentielles, et donc à procéder à une datation de gestation sur 24 femelles et leur foetus pour garantir d'en retenir 12.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans l'EU2 dans les zones d’hébergement expérimentales (en dehors de leurs groupes sociaux d’origine) avec au moins un congénère. Cette décision est une mesure de raffinement car la capture à répétition du même individu dans son groupe d’origine implique la manipulation de tous ses congénères ce qui induit un stress supplémentaire pour eux ainsi qu’une augmentation significative du temps de capture de l’animal. Tous les animaux feront partie d’un programme d’enrichissement lié au nourrissage quotidien impliquant au moins 4 moments par jour avec accès à fruits, légumes et graines, ainsi qu’au moins deux enrichissements à manipuler par jour. Tous les animaux font l’objet d’un suivi quotidien par l'équipe de zootechnie et vétérinaire selon les procédures mises en place par la Structure du bien-être animal de l'EU2. Lors de la capture et transfert hebdomadaire de l'EU2 à l'EU1, une méthode sans contention est privilégiée, consistant d’abord à isoler l’animal et le transférer dans une boite de transport accolée à la cage d’hébergement pour remise en cage de transport. Pendant le transport, les animaux sont maintenus dans le noir (effet calmant) par un cache sur la cage de transport. Le compartiment du véhicule agrée est climatisé si besoin. Chaque animal (mère) sera mis à jeun 12 heures avant l’anesthésie avec le maintien d’un accès à de l’eau (sucrée) tel que le prévoient les procédures de routine de l'EU2. Les acquisitions IRM sont réalisées sous anesthésie, pendant lesquelles les animauxseront surveillés et monitorés. Chaque anesthésie devrait durer entre 1h30 et 2h30 maximum. A l'issue de la dernière acquisition, la femelle et son congénère seront réintroduits dans leur groupe social d'origine. La femelle sera alors surveillée quotidiennement jusqu'à la mise bas. Une fois le bébé né, celui-ci sera surveillé quotidiennement par l'équipe de zootechnie et vétérinaire pendant 6 mois, pour s’assurer de son développement normal.

Choix des espèces

Parmi les espèces sur lesquelles une expérimentation est possible, les babouins sont l’espèce phylogénétiquement la plus proche de l’humain et celle offrant l’indice de gyrification le plus proche de l’humain (la gyrification étant le phénomène qui nous intéresse ici). Il s’agit aussi de l’espèce la plus grosse que nous puissions utiliser dans une IRM, ce qui est critique pour faire des acquisitions sur un cerveau de foetus, donc de très petite taille. Femelles gestantes et foetus entre la 8eme et la 24eme semaine de gestation. La 10ème semaine est celle à laquelle la datation de gestation par échographioe sera faite. Puis pour les foetus inclus, il seront scannés par IRM entre la 14eme et la 24eme semaine de gestation. Cet intervalle de gestation correspond à la période pendant laquelle la gyrification du cortex se met en place. Les 3 dernières semaines de gestation (25-27.5) ne peuvent être utilisées car le déplacement des femelles représente un risque d'avortement spontané.

22 babouins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit quatre anesthésies profondes de deux heures et 21 prélèvements sanguins sous anesthésie légère, avant une mise à mort sous anesthésie profonde pour prélèvement de plusieurs organes. Hébergés en volière avant le protocole, ils passent la durée de l'étude dans des cages séparées, seulement jointives. L'étude sert à caler la dose d'anticorps polyclonaux développés par une société privée avant l'essai de toxicité réglementaire, et le porteur écrit qu'il est "nécessaire" de valider l'innocuité de cette dose, deux animaux par dose suffisant selon lui à trancher.

Objectifs

Notre société développe des anticorps polyclonaux glyco-humanisés dans le domaine de la cancérologie notamment. Trois anticorps polyclonaux glyco-humanisés nouvellement développés dans le domaine de la cancérologie ont démontré leur efficacité dans des modèles murins précliniques. Des études de toxicité réglementaire sont requises chez le primate non humain par les recommandations réglementaires. En préalable à ces études et dans un souci de réduction du nombre d’animaux à inclure, il est nécessaire de valider l’innocuité d’une dose équivalente à la dose thérapeutique visée. Des prélèvements sanguins réguliers seront effectués afin d’effectuer un bilan cardiaque/musculaire, hépatique/pancréatique, inflammatoire. Les animaux seront observés quotidiennement et soumis à une grille d’observation comportementale, afin d’obtenir un bilan cognitif primaire. Les prélèvements sanguins seront aussi utilisés pour déterminer la pharmacocinétique du produit, conformément aux recommandations réglementaires. Cette étude préliminaire permettra de valider la bonne tolérance de la dose présumée, de mettre au jour d’éventuels points d’alerte qui permettront de prévoir une surveillance accrue et plus exhaustive de ces paramètres, et de limiter l’étude de toxicité réglementaire à un simple groupe à cette dose.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de valider la tolérabilité d’une dose thérapeutique

Procédures

4 anesthésies profondes par animal (2h) avec prélèvements, et 21 prélèvements sanguins sous anesthésie légère (15 min), euthanasie en fin de projet sous anesthésie profonde

Impact sur les animaux

Les anesthésies profondes de 2h ainsi que les prélèvements de sang multiples sous anesthésie légère peuvent occasioner de l'inconfort, de la confusion et du stress pour les animaux au moment du réveil, pour autant elles permettent de diminuer ces effets d'inconfort, de confusion et de stress pendant les procédures, les rendant ainsi le moins traumatisantes possible pour les animaux par rapport à ces mêmes procédures qui seraient effectuées sur animaux vigiles.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort, sous procédure complète d'anesthésie, en fin de protocole de gravité modérée pour prélèvement multi-organes post-mortem.

Remplacement

Cette autorisation de projet a pour objectif de valider la dose thérapeutique ciblée pour les anticorps polyclonaux 1, 2 et 3, de manière à optimiser l’étude de toxicité réglementaire nécessaire à la constitution du dossier de demande d’autorisation d’essai clinique. Les études pré-cliniques réalisées montrent que les primates non humains et le babouin notamment est l’espèce la plus représentative de l’homme pour l’évaluation de la toxicologie des anticorps car la cross-réactivité cellulaire est comparable.

Réduction

Pour chaque dose, le nombre d’animaux est réduit à son minimum soit 2 par dose, en raison de la variabilité interindividuelle. Le groupe contrôle est partagé pour tous les anticorps testés, toujours dans un objectif de réduction. De plus, le projet est divisé en 2 parties. Dans la partie 1 seul l’équivalent de la dose thérapeutique ciblée chez l’homme sera administrée. La dose forte ne sera pas administrée si une des précédentes doses a provoqué des effets indésirables graves

Raffinement

-De façon à diminuer le stress, la souffrance et la douleur, toutes les procédures seront réalisées chez ces animaux sous anesthésie générale. Un traitement analgésique leur sera donné si nécessaire en fonction de la procédure. -Les anesthésies et traitements analgésiques donnés aux animaux sont décrits dans les procédures. La fréquence d'observation des animaux est doublée lors des expérimentations et consiste en un examen clinique de l’animal selon une grille de signes notables, signes sévères et un arbre décisionnel -Si des effets indésirables apparaissent dès la première injection, la seconde injection ne sera pas réalisée. -Les animaux sont hébergés avant protocole expérimental en volière, de façon à préserver leur mode de vie en communauté, puis, au cours du protocole expérimental les individus sont hébergés dans des cages séparées, mais jointives permettant la vision et la communication entre congénères. Un enrichissement alimentaire (fruits et/ou légumes) est donné quotidiennement, un enrichissement du milieu par jeux (différentes activités) est donné en rotation dans les cages selon un programme hebdomadaire. Enfin, un aménagement (perchoirs, cordes…) des cages permet un enrichissement de mouvements.

Choix des espèces

Les primates non humains, ici les babouins, représentent des espèces animales de choix comme modèles animaux pré-cliniques, car proches de l’homme de par leur anatomie, leur physiologie, leur métabolisme, leur proximité phylogénétique et leur similitude avec le système immunitaire de l’homme. Les investigations in vivo sur une espèce représentative est un prérequis obligatoire par les autorités réglementaires avant d’envisager un essai clinique chez l’homme. Les animaux seront inclus à un stade jeune adulte, afin de présenter un système immuntaire mature.