Macaques à longue queue

78 des 174 macaques à longue queue de ce projet doivent être gardés en vie puis réutilisés dans d'autres études, les 96 autres tués pour analyser leurs tissus infectés. Dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 144 d'entre eux sont colonisés par des bactéries hospitalières, parfois multirésistantes, et tous subissent jusqu'à sept anesthésies générales et neuf prises de sang par semaine, des lavages rectaux, des traitements et l'implantation d'une puce de télémétrie, certains des biopsies rectales et des gavages d'antibiotiques. Après l'inoculation, chaque macaque est logé seul, face à un congénère à deux mètres. Sur le remplacement, le porteur affirme que l'usage de primates "reste nécessaire", malgré "les efforts pour privilégier ces alternatives", qu'il ne décrit pas.

Objectifs

L’étude des sepsis, c’est-à-dire des réactions anormales et excessives de l’organisme face à une infection, constitue un enjeu majeur de santé publique. Les sepsis engendrent une mortalité élevée, estimée à environ 11 millions de décès par an dans le monde, due à l’absence de traitements réellement efficaces. Les formes les plus sévères de sepsis sont le plus souvent liées à des bactéries retrouvées dans les intestins. Ces bactéries finissent par circuler dans les hôpitaux et représentent aujourd’hui une menace importante pour les systèmes de santé. De plus, la résistance aux antibiotiques développée par ces bactéries constitue un problème de plus en plus préoccupant à l’échelle mondiale. Cette augmentation de la résistance aux antibiotiques rend le traitement des infections graves beaucoup plus difficile et accroît le risque de développer des sepsis sévères. Dans ce contexte, le développement de stratégies visant à prévenir l’infection en réduisant ou en éliminant, au niveau de l’intestin, les bactéries susceptibles de provoquer des infections chez les patients à risque apparaît comme une approche prometteuse contre à la fois le sepsis et la multirésistance aux antibiotiques. L’étude envisagée vise à mettre en place un modèle de colonisation digestive chez des primates non humains par des bactéries pertinentes du contexte hospitalier, multirésistantes ou non, afin d’évaluer, tester et optimiser des stratégies innovantes permettant d’éliminer ces bactéries.

Bénéfices attendus

Le projet permettra le développement de modèles de colonisation intestinale par différentes bactéries d’intérêt pour tester de nouvelles stratégies de décolonisation intestinale pouvant être utilisées chez des patients à risque avant le développement d’infections sévères.

Procédures

- Les interventions prévues dans ce projet seront réalisées sous anesthésie générale et seront regroupées pour limiter leur nombre (1 à 7 fois par semaine, 174 animaux, 30-45 minutes). Prélèvements : - Prélèvements sanguins (1 à 9 fois par semaine, 174 animaux, 5 minutes - Récoltes de fluides rectaux/trachéaux ou nasaux (1 à 5 fois par semaine, 174 animaux 2 minutes). - Biopsies rectales, (2 fois maximum, 30 animaux, 30 minutes). - Lavages rectaux (1 à 2 fois par semaine, 126 animaux, 20 minutes). - Lavages broncho-alvéolaires (jusqu’à 2 fois si un problème respiratoire est observé, jusqu’à 144 animaux, 10 minutes). Interventions - Inoculation bactérienne (1 fois 144 animaux, 5 minutes). - Traitements avec des molécules thérapeutiques (ou placebo) (jusqu’à 6 fois, 174 animaux, 5 minutes). - Traitements avec des antibiotiques par gavage (4 fois 144 animaux, 5 minutes) - Imageries in vivo (jusqu’à 2 fois si un problème respiratoire est observé, jusqu’à 144 animaux, 45 minutes).

Impact sur les animaux

Les méthodes expérimentales ont été définies de manière à éviter toute souffrance lors des interventions (limitation des volumes sanguins prélevés, expositions et traitements réalisés sous anesthésie générale). Anesthésies, prélèvements de sang Perte d’appétit avec perte de poids mineure, anémie transitoire (légère à modérée), hématome au niveau du site du prélèvement, infection au site d’injection possible dans les jours qui suivent le prélèvement (rare, quelques jours). Traitements Réaction locale, démangeaisons et/ou douleur dans les heures/jours suivant le traitement. Perturbation de la flore intestinale, vomissement et/ou diarrhée transitoire. Colonisation L’étape de colonisation ne s’accompagne souvent d’aucun signe clinique particulier. Cependant, en cas de passage des bactéries dans le sang ou d’infections pulmonaires, des signes cliniques de l’infection bactérienne peuvent apparaitre : fièvre, perte d’appétit, difficultés respiratoires pendant quelques jours. Nuisances liées aux traitements antibiotiques L’altération de la flore intestinale peut causer des diarrhées et entérites (quelques jours) Implantation de puces de télémétrie Réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie (rare), démangeaisons, durée de 1 à 5 jours. Biopsies rectales : Des signes cliniques liés aux biopsies rectales : réaction inflammatoire au site de la biopsie, perte d’appétit, saignements, pendant quelques heures/jours Nuisances liées à l’hébergement individuel : Les animaux seront hébergés en groupe avant exposition et en hébergements individuels proches, permettant des interactions sociales pendant la phase d’expérimentation. Nuisances suite aux écouvillonnages : Saignement pouvant aller de quelques secondes à quelques minutes. Nuisances liées aux lavages broncho-alvéolaires : Irritation de la trachée liée à l’intubation. Toux, difficultés respiratoires légères juste après le geste. Nuisance liée à la mise à jeun (

Devenir

Pour l’étude de mise en place de modèle : les animaux seront gardés en vie et réutilisés dans d’autres études compatibles après avis vétérinaire. Cependant, si les animaux montrent des signes d’infection, ils seront euthanasiés afin d’étudier l’infection dans les tissus. Dans l’étude d’évaluation de la sécurité des traitements, les animaux seront gardés en vie et réutilisés dans d’autres études après avis favorable du vétérinaire. Dans les études d’efficacité des traitements, tous les animaux seront euthanasiés, dans le but de faire des analyses des tissus infectés.

Remplacement

Ce projet vise à mettre en place des modèles de colonisation intestinale par des bactéries souvent retrouvées chez des patients hospitalisés, afin d’établir de nouvelles stratégies thérapeutiques de décolonisation. À ce jour, les méthodes alternatives telles que les études menées sur des cellules en laboratoire (approches in vitro), sur des modèles informatiques (in silico), ou encore sur des tissus isolés (ex vivo) ne permettent pas de reproduire, la complexité des interactions entre le système immunitaire et les bactéries de l’intestin. C’est pourquoi, malgré les efforts pour privilégier ces alternatives, l’utilisation de modèles animaux reste nécessaire pour atteindre les objectifs du projet. Le primate non-humain, étant proche de l’humain au niveau anatomique, immunitaire et physiologique, permet de reproduire la complexité de ces interactions, nécessaires pour permettre une colonisation intestinale par des bactéries retrouvées chez les patients. Cela permet ainsi d’évaluer de façon fiable tout nouveau traitement avant son utilisation chez l’être humain.

Réduction

Dans ce projet, plusieurs mesures sont mises en place pour utiliser le moins d’animaux possible tout en garantissant des résultats fiables. Dans la phase de mise en place du modèle, les conditions optimales d’inoculation de la bactérie seront déterminées selon un procédé étape par étape, déjà publié dans la littérature scientifique. Cette méthode permet de réduire le nombre d’animaux, en évitant de multiplier les essais. Dans les études de tolérance et de distribution, seules les stratégies de décolonisation ayant déjà démontré une efficacité chez le petit animal (rongeurs) seront testées dans cette étude chez le primate non humain. Ensuite, pour affiner les paramètres importants comme la sécurité, la dose ou la manière d’administrer les traitements, seuls de petits groupes d’animaux seront utilisés. Cela permettra de sélectionner les meilleures conditions avant de passer à des études d’efficacité. Enfin, pour les études d’efficacité, le nombre d’animaux par groupe est limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats solides et interprétables. Ce nombre a été déterminé de façon à pouvoir détecter des différences statistiques entre les groupes.

Raffinement

Les prélèvements et interventions sur les animaux sont réduits au minimum nécessaire pour répondre aux objectifs du projet. Ils seront effectués sous anesthésie générale pour éviter le stress et d’éventuelles douleurs et seront regroupés au maximum lors d’une même anesthésie afin de réduire leur nombre. Les anesthésies pouvant entrainer une diminution de l’appétit, une diversification et complémentation de l’alimentation sera instaurée au besoin. Les animaux seront hébergés en groupes puis en hébergements individuels proches permettant des interactions sociales après inoculation bactérienne (conservation du contact sensoriel, et hébergements face à face séparés de 2 m). Le programme d’enrichissement sera étendu par ajout de dispositifs alimentaires, jouets, et par renforcement du contact positif. Cet hébergement individuel est nécessaire pour éviter les biais lors de l’évaluation de la température mesurée par puce électronique, éviter une contamination croisée, et permettre d’associer le prélèvement d’excréments à l’animal. Le vétérinaire de l’installation sera alerté en cas d’apparition de signes cliniques liés au traitement afin d’adapter le suivi et les soins aux animaux ainsi que leur alimentation (des points limites sont mis en place). Les prélèvements de sang et les biopsies pouvant entrainer l’apparition d’une réaction locale, un traitement symptomatique pourra être mis en place (désinfection, anti-douleurs localement). L’implantation de puces électroniques, permettant un suivi régulier de la température corporelle, peut induire une réaction au site d’incision. Un signalement au vétérinaire sera effectué, qui pourra appliquer un traitement symptomatique (désinfection, analgésie locale). Un traitement anti-douleur sera appliqué avant la chirurgie.

Choix des espèces

Dans ce projet, le macaque a été sélectionné pour sa proximité génétique, anatomique et physiologique avec l’être humain. Son appareil digestif ressemble beaucoup à celui de l’être humain au niveau anatomique, mais aussi au niveau de l’environnement intestinal incluant le microbiote. Le macaque reproduit la complexité des interactions entre le système immunitaire et les bactéries naturellement présentes dans l’intestin. Cela en fait un modèle particulièrement pertinent pour l’étude de la colonisation bactérienne par des bactéries retrouvées chez l’être humain et l’étude de la tolérance à de nouveaux traitements. Ces bactéries pouvant être retrouvées dans l’intestin de personnes de tout âge, nous envisageons de réaliser les procédures sur des animaux ayant un panel d’âge étendu. Cependant, les nouveau-nés n’ayant pas un système immunitaire complètement développé, nous nous focaliserons sur des animaux sevrés et ayant un système immunitaire mature et un microbiote intestinal stable.

Prélever du sang, des urines, de la salive, du sperme, du liquide cérébrospinal ou des biopsies d'organes, non pour une expérience mais pour vérifier que les méthodes de dosage des laboratoires fonctionnent : 360 macaques à longue queue sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. La contention dure jusqu'à une heure en chaise, la mise à jeun jusqu'à dix-huit heures, et le recueil de sperme passe par un léger courant électrique. Le porteur présente ces prélèvements comme un apport aux "3R", au motif que des méthodes plus sensibles réduiront plus tard les volumes prélevés et le nombre d'animaux non-humains utilisés. Le champ structuré annonce 356 macaques réutilisés et 4 rendus à l'élevage, quand la narration prévoit qu'un vétérinaire délivre une autorisation exceptionnelle de mise à mort pour ceux qui ne peuvent être ni réutilisés ni réhabilités, leurs organes allant alors aux laboratoires.

Objectifs

Aujourd’hui, un nombre croissant de candidats médicaments sont des protéines thérapeutiques ou des molécules biologiques plus ou moins complexes. Le primate non humain constitue souvent la seule espèce pertinente pour évaluer leur toxicité ou leur activité pharmacologique, en raison de fortes homologies génétiques, immunologiques et physiologiques avec l’être humain. Ces études d’évaluation sont requises par les autorités réglementaires, et des lignes directrices définissent les modalités de leur conduite. Elles incluent généralement un ensemble étendu d’analyses de laboratoire destinées à mesurer la concentration plasmatique (ou dans d’autres matrices) du composé testé et à la corréler à son activité pharmacologique ou toxique. Compte tenu des enjeux scientifiques et réglementaires, il est essentiel que les résultats obtenus soient fiables et robustes. Cette fiabilité ne peut être garantie qu’après la démonstration documentée des performances analytiques des méthodes au cours de leur qualification et/ou validation. Toutefois, la composition des échantillons peut influencer les résultats et la performance analytique d’un essai. Il est donc indispensable d’évaluer ces paramètres dans des échantillons biologiques de même nature que ceux qui seront analysés dans les études réglementaires. Par conséquent, la réalisation de prélèvements biologiques provenant de primates non humains, en amont ou en parallèle des études, est nécessaire pour valider les méthodes analytiques utilisées lors de l’analyse des échantillons d’étude. Par ailleurs, le développement et la validation réglementaire de nouvelles méthodes ou de techniques plus sensibles et plus précises contribuent directement aux principes des 3R. Elles permettent notamment de réduire les volumes de matrices biologiques requis et d’obtenir des données plus détaillées, améliorant ainsi l’interprétation scientifique tout en limitant l’utilisation d’animaux.

Bénéfices attendus

Le projet a pour objectif de collecter des échantillons biologiques (comme du sang ou du plasma) nécessaires pour développer et vérifier la fiabilité des tests utilisés dans nos laboratoires. Ces tests sont indispensables pour obtenir des données fiables et reconnues par les autorités, ce qui est essentiel pour développer de futurs médicaments. Le projet apporte deux types de bénéfices : 1. Un bénéfice scientifique et réglementaire (à court et moyen terme) Les laboratoires auront accès à des échantillons de bonne qualité, prélevés directement sur place. Cela évite les problèmes liés au transport ou à la conservation, qui peuvent dégrader la qualité des analyses. Ces échantillons permettent de mettre au point et de valider les méthodes nécessaires aux études de toxicologie et au développement de nouveaux médicaments. 2. Un bénéfice important pour le respect des 3R (Réduire, Raffiner, Remplacer) Les méthodes de laboratoire deviennent de plus en plus sensibles et précises. Cela permet : • d’utiliser des volumes beaucoup plus faibles d’échantillons, • d’analyser plus de paramètres en même temps, • d’obtenir des résultats plus détaillés. En conséquence, il est souvent possible de réduire le nombre d’animaux nécessaires dans les études futures. Par exemple, des techniques comme les analyses multiparamétriques (Multiplex Luminex®, électrochimiluminescence, PCR digitale) permettent de mesurer plusieurs éléments différents dans un seul petit échantillon de plasma.

Procédures

Les prélèvements seront réalisés en respectant les recommandations éthiques en vigueur adaptées au type de prélèvement et en respectant une période de récupération adaptée pour l’animal entre deux prélèvements et selon des recommendations de vétérinaire. Les prélèvements réalisés chez l’animal vigile : sang (unique ou répété) par les voies veineuses périphériques, urines, selles, frottis vaginal, nécessitent une contention de courte durée, manuelle (moins de 5 minutes) et/ou en chaise de contention (jusqu’à 30 minutes ou 1 heure maximum). Les prélèvements réalisés chez l’animal vigile (ex jeune animal) ou sous sédation (des animaux matures) : salive, larmes, sécrétions nasales, recueil du sperme ; si une sédation est requise, elle sera de courte durée (environ 5-15 minutes) Les prélèvements réalisés sous anesthésie générale : biopsie cutanée ou d’organes, cytoponction, liquide cérébrospinal, liquide synovial, humeur aqueuse Dans certains cas particuliers les prélèvements exigent des contraintes d’hébergement particulières : • Mise à jeun (préalablement à une anesthésie, maximum 18 heures) ; • Hébergement individuel (contacts olfactifs, visuels, sonores préservés, pour recueil d’urine/fèces en cage à diurèse, en vue d’une analyse individuelle, maximum 18 heures).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont minimes et correspondent essentiellement au stress et douleurs liés à la contention et aux types de prélèvements : Prélèvements sur animaux vigiles : hématome transitoire sur le site de prélèvement sanguin, légère douleur provoquée par la ponction à l’aiguille, stress provoqué par la contention et/ou l’hébergement individuel (contacts olfactifs, visuels, sonores… préservés), le cas échéant, de l’éjaculation par un léger courant pour prélevement de sperme Sédation/Anesthésie générale : effets cardiorespiratoires, hypothermie, stress provoqué par les manipulations liées à l’anesthésie Prélèvements plus invasifs comme les biopsies : douleurs au niveau du site de biopsie, stress provoqué par l’intervention post-opératoire comme la contention pour les soins post-opératoires et les injections répétées. Stress lié à des contraintes occasionnelles d’hébergement : notamment lors d’un hébergement individuel, ainsi que lors des contentions manuelles, en chaise lorsque nécessaire, ou par collier. De légères gênes ou frottements peuvent survenir en lien avec ces méthodes de contention.

Devenir

Après avoir pris en compte les effets subis par l’animal, notamment lors de sa participation à des projets ou procédures antérieurs, et en tenant compte de l’ensemble des paramètres sanitaires, le vétérinaire émettra un avis sur sa réutilisation potentielle. Si, selon cet avis, l’animal ne peut être ni réutilisé dans un autre projet ni réhabilité, une autorisation exceptionnelle d’euthanasie pourra être délivrée par le vétérinaire. Dans ce cas, différents matrixes pourront être prélevés en post‑mortem et mis à disposition des laboratoires. Sous réserve de satisfaire aux critères de réutilisation définis par la réglementation, ces animaux pourront être réaffectés au présent projet ou à un autre projet autorisé. Leur suivi sera assuré conformément aux procédures institutionnelles et en stricte conformité avec les exigences réglementaires applicables (Directive 2010/63/UE, référentiel AAALAC, ainsi que les autres recommandations éthiques internes).

Remplacement

Les lignes directrices de validation de méthodes recommandent que les essais soient validés dans les mêmes matrices que les échantillons d’étude (même espèce), afin de s’assurer de la performance des essais dans leur utilisation réelle. A l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode in vitro permettant de synthétiser ces produits biologiques en raison de la complexité des matrices biologiques utilisés dans ce projet, et les matrices primates ne peuvent pas être remplacées par des matrices d’autres espèces du fait de la règlementation et de la nature des candidats testés (ex : protéines thérapeutiques).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet sera déterminé strictement selon les besoins des laboratoires et la réglementation en vigueur en termes de validation d’essais. Les prélèvements seront effectués pour les analyses prévues en utilisant le nombre d’animaux minimum requis. Par ailleurs, le développement de nouvelles méthodes et de techniques plus sensibles dans les laboratoires permet de limiter la quantité de matrice biologique nécessaire, contribuant ainsi à la réduction (3R) ultérieurement.

Raffinement

Les techniques et les méthodes de laboratoire deviennent de plus en plus sensibles et précises, ce qui renforce l’efficacité des analyses. Les essais ex vivo réalisés en amont des études précliniques in vivo s’inscrivent dans une stratégie 3R (réduction et raffinement en particulière) car ils permettent de caractériser le candidat médicament (sélection du meilleur candidat, connaissance du profil métabolique, pharmacologique et toxicologique) avant de démarrer les essais sur l’animal. Les méthodes développées et validées dans ce projet permettent en particulier d’optimiser les doses utilisées ensuite pour les études vivo, et de limiter la quantité de matrice biologique nécessaire, ex : approches permettant de doser plusieurs analytes à partir d’un volume réduit de plasma (analyses Multiplex avec la technologie Luminex®) et techniques plus sensibles et plus précises (électrochimie luminescence ou PCR digitale permettant des interprétations plus fines). Les actes pouvant engendrer du stress, de l’inconfort ou des douleurs importantes seront réduits au minimum nécessaire et seront réalisés sous sédation ou anesthésie générale avec un protocole analgésique adapté (multimodale) le cas échéant. Dans le cas où l’anesthésie est jugée plus traumatisante pour l’animal et/ou si l’anesthésie est incompatible avec les prélèvements prévus, les prélèvements seront réalisés sur l’animal vigile, notamment les prélèvements sanguins et le recueil d’urine, par exemple. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long du projet et évalué grâce à la mise en place de points limites (ex : plaie, gonflement au niveau du site de prélèvement, amaigrissement) qui permettront d'intervenir immédiatement s'il y a un signe d’inconfort ou de souffrance et de veiller au bien-être des animaux.

Choix des espèces

Aujourd’hui, de nombreux candidats médicaments sont des protéines thérapeutiques ou des biomolécules complexes. Le primate non humain est souvent la seule espèce pertinente pour étudier leur toxicité ou leur activité pharmacologique, en raison de sa proximité génétique, immunologique et physiologique avec l’être humain. Ces études sont exigées par les autorités réglementaires et suivent des lignes directrices précises. Elles nécessitent de nombreuses analyses permettant de mesurer la concentration du composé dans le plasma (ou d’autres matrices) et de la relier à ses effets pharmacologiques ou toxiques. Pour garantir la fiabilité des résultats, les méthodes analytiques doivent être qualifiées ou validées. Or, la composition des échantillons peut influencer la performance des essais. Il est donc essentiel d’utiliser des échantillons provenant de primates non humains, identiques à ceux analysés dans les études. Ainsi, des prélèvements biologiques doivent être réalisés en amont ou en parallèle des études. Les animaux utilisés sont généralement des juvéniles d’au moins 22 mois, âge auquel ils arrivent dans l’établissement et sont inclus dans les études réglementaires. Pour certains types de prélèvements, des animaux matures (sexuellement ou immunologiquement) peuvent être nécessaires, en fonction des besoins scientifiques et de leur disponibilité.

Deux heures d'anesthésie pour une IRM, avec des nausées, des vomissements et des troubles respiratoires ou cardiovasculaires donnés comme effets secondaires fréquents, puis quatre heures de chirurgie et des douleurs post-opératoires transitoires. 6 macaques, trois rhésus et trois à longue queue, âgés de 4 à 8 ans, sont utilisés dans cette seconde partie du projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et tous sont tués pour l'étude post-mortem de leur cerveau. S'y ajoutent une heure hebdomadaire de contention pour un test de préhension de nourriture et des séances d'enregistrement des cellules nerveuses, afin de mesurer l'effet d'une surexpression de calbindine sur les circuits moteurs. Les retombées restent lointaines, le porteur écrivant que ces travaux "pourraient aider à identifier de nouvelles pistes" à moyen terme, quand les quatre heures de chirurgie et les un à deux mois d'habituation à l'animalerie sont, eux, programmés.

Objectifs

Cette étude se déroulera sur deux établissements utilisateurs. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre le rôle d’une protéine impliquée dans la régulation du calcium, la calbindine, élément essentiel au bon fonctionnement des neurones. Nous étudions son action dans un circuit du cerveau impliqué dans le contrôle des mouvements, un circuit souvent touché dans des maladies neurodégénératives. Chez les rongeurs, un manque de cette protéine fragilise les neurones, tandis que le rétablissement de sa production sur des cellules en culture semble les protéger. Chez le macaque, nos travaux montrent qu’elle pourrait aussi jouer un rôle important dans le contrôle de la motricité.

Bénéfices attendus

Nous étudions son action dans un réseau cérébral impliqué dans le contrôle des mouvements, un réseau souvent perturbé dans les maladies neurodégénératives. En obtenant des résultats chez le macaque, nous cherchons à comprendre comment cette protéine influence la santé des neurones et le bon fonctionnement des circuits responsables de la motricité. À moyen terme, ces travaux pourraient aider à identifier de nouvelles pistes pour mieux traiter certains troubles moteurs.

Procédures

IRM (EU2, 2 heures), la chirurgie (EU1, 4 heures), enregistrements des cellules nerveuses (1 heure par séance). Prélèvements sanguins potentiels (15 minutes, 1 fois par semaine). Tests comportementaux (EU1, 1 heure/hebdomadaire).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables sont liés à l’anesthésie pour l’IRM (2 heures, effets secondaires fréquents tels que nausées, vomissements, ainsi que des troubles respiratoires ou cardiovasculaires) et la chirurgie (4 heures, douleurs post-opératoires transitoires). Les nuisances sont liées aux prélèvements sanguins (15 minutes, stress modéré lié à l’immobilisation et à l’environnement expérimental) ainsi qu’a la contention pendant le test comportemental de préhension de nourriture (1 heure, stress modéré lié à l’immobilisation et à l’environnement expérimental) ainsi que pour les enregistrements électrophysiologiques (1h, stress lié à l’immobilisation).

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure pour une étude post-mortem du cerveau.

Remplacement

Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du primate non humain (PNH) car il n’existe pas de modèles mathématiques valides et réalistes permettant d’étudier les lésions dues à de tels symptômes moteurs. Nous recherchons à travers l’utilisation des modèles animaux complexes et intégrés à coller à la réalité de la pathologie humaine, impossible à trouver dans des modèles cellulaires. De ce fait, le recours à l’animal, tout d’abord le rongeur (données de la littérature), puis ici, le PNH (du fait de sa proximité avec l’homme) pour étudier les mécanismes impliqués dans ces processus lésionnels et réparateurs est une étape préliminaire nécessaire à la mise en place de nouvelles thérapies.

Réduction

Nos modèles sont générés sur un plateau de haute technicité nous permettant la manipulation des animaux dans les meilleures conditions et une grande reproductibilité dans les différents modèles, ce qui limite le nombre d'animaux.

Raffinement

Un protocole d’acclimatation et d’habituation progressif des singes à leur nouvel environnement d’animalerie est mis en place pendant 1 à 2 mois. Les chirurgies sont faites sous anesthésie générale et avec une couverture antalgique permettant de réduire le plus possible les douleurs ressenties, des soins appropriés en cas d’atteinte de points limites sont prodigués, avec un scoring permettant de décider des actions conservatoires à apporter. Les compléments alimentaires, lait enrichi et jus sont quelques outils dont nous disposons, nous permettant de concourir à l’amélioration de l’état de santé de nos animaux. Les chirurgies sont faites sous anesthésie générale et avec une couverture antalgique permettant de réduire le plus possible les douleurs ressenties. Pendant le transport pour réaliser l’IRM, le singe est maintenu au chaud sous une couverture et bordé d’une bouillotte, ses paramètres vitaux sont surveillés.

Choix des espèces

Le choix du macaque se justifie par la proximité phylogénétique, anatomique et fonctionnelle de son système nerveux central avec celui de l’Homme, en particulier au niveau du contrôle moteur. Contrairement aux modèles de rongeurs, le macaque présente une spécialisation des circuits moteurs hautement comparable à celles observées chez l’humain. Ce modèle permet ainsi une investigation plus fine des corrélats neurobiologiques de la motricité et une meilleure transposabilité des résultats, notamment pour l’étude des mécanismes physiopathologiques et l’identification de cibles thérapeutiques pertinentes. Le choix du stade de développement adulte se justifie par la nécessité d’étudier un système nerveux central pleinement maturé, caractérisé par une organisation stabilisée des circuits nerveux et une homéostasie calcique comparable à celle observée chez l’adulte humain. Les animaux ont en général entre 4 et 8 ans, en fonction de leur origine. Par ailleurs, les troubles moteurs associés aux maladies neurodégénératives surviennent majoritairement à l’âge adulte, rendant ce stade développemental particulièrement pertinent pour garantir la validité translationnelle des résultats.

6 macaques, trois à longue queue et trois rhésus, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour une étude post-mortem du cerveau. Chacun subit deux heures d'IRM sous anesthésie, quatre heures de chirurgie, des séances d'une heure d'enregistrement de ses cellules nerveuses, des prélèvements de sang hebdomadaires de quinze minutes et un test comportemental de préhension de nourriture d'une heure par semaine, sous contention. Il s'agit d'observer l'effet d'une surexpression de calbindine, protéine de régulation du calcium, sur un circuit cérébral du contrôle des mouvements. Sur le remplacement, le porteur écrit qu'il n'existe pas de "modèles mathématiques valides et réalistes" pour cette question et que le recours au primate non humain, "du fait de sa proximité avec l'homme", constitue "une étape préliminaire nécessaire" aux thérapies visées.

Objectifs

Cette étude se déroulera sur deux établissements utilisateurs. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre le rôle d’une protéine impliquée dans la régulation du calcium, la calbindine, élément essentiel au bon fonctionnement des neurones. Nous étudions son action dans un circuit du cerveau impliqué dans le contrôle des mouvements, un circuit souvent touché dans des maladies neurodégénératives. Chez les rongeurs, un manque de cette protéine fragilise les neurones, tandis que le rétablissement de sa production sur des cellules en culture semble les protéger. Chez le macaque, nos travaux montrent qu’elle pourrait aussi jouer un rôle important dans le contrôle de la motricité.

Bénéfices attendus

Nous étudions son action dans un réseau cérébral impliqué dans le contrôle des mouvements, un réseau souvent perturbé dans les maladies neurodégénératives. En obtenant des résultats chez le macaque, nous cherchons à comprendre comment cette protéine influence la santé des neurones et le bon fonctionnement des circuits responsables de la motricité. À moyen terme, ces travaux pourraient aider à identifier de nouvelles pistes pour mieux traiter certains troubles moteurs.

Procédures

IRM (EU2, 2 heures), la chirurgie (EU1, 4 heures), enregistrements des cellules nerveuses (1 heure par séance). Prélèvements sanguins potentiels (15 minutes, 1 fois par semaine). Tests comportementaux (EU1, 1 heure/hebdomadaire).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables sont liés à l’anesthésie pour l’IRM (2 heures, effets secondaires fréquents tels que nausées, vomissements, ainsi que des troubles respiratoires ou cardiovasculaires) et la chirurgie (4 heures, douleurs post-opératoires transitoires). Les nuisances sont liées aux prélèvements sanguins (15 minutes, stress modéré lié à l’immobilisation et à l’environnement expérimental) ainsi qu’a la contention pendant le test comportemental de préhension de nourriture (1 heure, stress modéré lié à l’immobilisation et à l’environnement expérimental) ainsi que pour les enregistrements électrophysiologiques (1h, stress lié à l’immobilisation).

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure pour une étude post-mortem du cerveau.

Remplacement

Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du primate non humain (PNH) car il n’existe pas de modèles mathématiques valides et réalistes permettant d’étudier les lésions dues à de tels symptômes moteurs. Nous recherchons à travers l’utilisation des modèles animaux complexes et intégrés à coller à la réalité de la pathologie humaine, impossible à trouver dans des modèles cellulaires. De ce fait, le recours à l’animal, tout d’abord le rongeur (données de la littérature), puis ici, le PNH (du fait de sa proximité avec l’homme) pour étudier les mécanismes impliqués dans ces processus lésionnels et réparateurs est une étape préliminaire nécessaire à la mise en place de nouvelles thérapies.

Réduction

Nos modèles sont générés sur un plateau de haute technicité nous permettant la manipulation des animaux dans les meilleures conditions et une grande reproductibilité dans les différents modèles, ce qui limite le nombre d'animaux.

Raffinement

Un protocole d’acclimatation et d’habituation progressif des singes à leur nouvel environnement d’animalerie est mis en place pendant 1 à 2 mois. Les chirurgies sont faites sous anesthésie générale et avec une couverture antalgique permettant de réduire le plus possible les douleurs ressenties, des soins appropriés en cas d’atteinte de points limites sont prodigués, avec un scoring permettant de décider des actions conservatoires à apporter. Les compléments alimentaires, lait enrichi et jus sont quelques outils dont nous disposons, nous permettant de concourir à l’amélioration de l’état de santé de nos animaux. Les chirurgies sont faites sous anesthésie générale et avec une couverture antalgique permettant de réduire le plus possible les douleurs ressenties. Pendant le transport pour réaliser l’IRM, le singe est maintenu au chaud sous une couverture et bordé d’une bouillotte, ses paramètres vitaux sont surveillés.

Choix des espèces

Le choix du macaque se justifie par la proximité phylogénétique, anatomique et fonctionnelle de son système nerveux central avec celui de l’Homme, en particulier au niveau du contrôle moteur. Contrairement aux modèles de rongeurs, le macaque présente une spécialisation des circuits moteurs hautement comparable à celles observées chez l’humain. Ce modèle permet ainsi une investigation plus fine des corrélats neurobiologiques de la motricité et une meilleure transposabilité des résultats, notamment pour l’étude des mécanismes physiopathologiques et l’identification de cibles thérapeutiques pertinentes. Le choix du stade de développement adulte se justifie par la nécessité d’étudier un système nerveux central pleinement maturé, caractérisé par une organisation stabilisée des circuits nerveux et une homéostasie calcique comparable à celle observée chez l’adulte humain. Les animaux ont en général entre 4 et 8 ans, en fonction de leur origine. Par ailleurs, les troubles moteurs associés aux maladies neurodégénératives surviennent majoritairement à l’âge adulte, rendant ce stade développemental particulièrement pertinent pour garantir la validité translationnelle des résultats.

Trois macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit un anticorps anticancéreux par perfusion intraveineuse de trente minutes, placé sur une chaise de contention pendant environ quarante minutes. Les trois subissent quatorze prélèvements sanguins totalisant 53 ml en quatre semaines, et les deux qui poursuivent la seconde phase dix-huit de plus, pour 65 ml en cinq semaines. Deux seront tués pour le prélèvement de leurs organes, le troisième gardé en vie et réutilisable après accord du vétérinaire. L'objet immédiat de l'étude est d'affiner les doses et les protocoles d'études réglementaires ultérieures, elles aussi menées sur des primates.

Objectifs

Ce projet vise à évaluer les effets biologiques ainsi que le devenir dans l’organisme d’un anticorps développé pour cibler et éliminer les cellules tumorales dans le cadre du développement d’un futur traitement anticancéreux destiné à l’homme. Cet anticorps sera administré par voie intraveineuse chez le macaque en administration unique à trois doses distinctes (phase 1) puis selon un schéma d’administrations répétées (cinq injections) à deux niveaux de dose (phase 2). La selection des deux doses pour les administrations répétées sera basée sur les résultats des adminsitrations uniques. Cette étude permettra d’identifier les doses et les modalités d’administration les plus adaptées en vue de la réalisation de futures études à plus grande echelle et réglementaires. Ce projet constitue donc une étape importante et indispensable dans le processus de développement et de sélection des doses du candidat médicament.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont, à terme, la validation et la mise sur le marché d’un nouvel anticorps capable de créer une thérapie anticancéreuse ciblée et puissante. Cette étude génèrera des données scientifiques qui permettront d’affiner les protocoles des études à plus grandes echelles puis des études règlementaires sur le primate. Ainsi les connaissances acquises permettront de sélectionner la meilleure dose et le meilleur schéma d’administration mais aussi d’adapter les méthodes de suivi et de raffinement spécifiques aux primates.

Procédures

Trois animaux réaliseront la phase 1 et à l’issue de cette phase, deux animaux continueront vers la phase 2 Les animaux vigiles recevront un candidat médicament par voie intra-veineuse de façon unique à différentes dose (faible, moyenne, haute) lors de la première phase puis deux doses seront selectionnées pour poursuivre les administrations répétées (x5) pour la seconde phase. L’injection durera 30 minutes et la contention sur chaise durera environ 40 minutes. Pour la seconde phase, es animaux bénéficieront d’une période de repos d’une semaine entre les administrations. Les animaux auront également 14 prélèvements de 1 à 5 ml, pour une volume total prélevé de 53 ml sur 4 semaines en phase 1 et 18 prélèvements de 1 à 8,5ml, pour une volume total prélevé de 65 ml sur 5 semaines en phase 2. Les animaux seront vigiles mais une sédation sera envisagée en cas de besoin. Chaque prélèvement dure entre 3 à 15 minutes (contention et prélèvement compris) Le suivi des paramètres physiologiques (poids et température corporelle) tout au long du projet nécessitera une contention d’environ 5 minutes. Pour le confort des animaux, certains prélèvements et suivis pourront être réalisés simultanément (ce qui diminuera le nombre de manipulations et de contentions). Des points limites précoces ont été déterminés afin de prendre en charge toute forme de douleur ou de souffrance. En cas d’atteinte d’un de ces points, l’animal concerné sera pris en charge selon les recommandations du vétérinaire.

Impact sur les animaux

Sur la base du mode d’action des anticorps et de leur potentielle cible sur les cellules de l'immunité, une réaction de type fièvre peut apparaître les jours suivant les administrations liées à un relargage de cytokines. La réalisation de prélèvements sanguins et les administrations par voie intraveineuse pourront également provoquer un stress, une douleur légère et/ou l’apparition de réactions locales (du type hématome ou œdème léger par exemple) au niveau de la zone de ponction ou d’injection. Durant les administrations, les animaux seront placés sur des chaises à contention ce qui a pour conséquence de réduire leurs mouvements.

Devenir

Deux doses seront sélectionnées en fin de procédure 1 pour être évaluée dans la procédure 2 (sur 2 animaux). L’animal non utilisé pour la procédure 2 sera gardé en vie et pourra être réutilisé (après accord du vétérinaire). En fin de procédure 2, tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet dans le but de récolter les organes et d’évaluer la toxicité du candidat médicament.

Remplacement

Les études de pharmacocinétique et de toxicité chez l’animal sont indispensables au développement de nouvelles molécules pharmaceutiques. En effet, celles-ci permettent de déterminer la biodisponibilité des candidats médicaments et permettent d’affiner la connaissance de l’effet principal et des effets indésirables éventuels. Les modèles animaux permettent dans ce cas d'objectiver l'apparition des signes cliniques et donc de mettre en évidence une éventuelle toxicité de la molécule en test. Actuellement, aucune méthode alternative à l'utilisation des animaux n'est susceptible d'apporter le même niveau d'information qu'un organisme vivant entier et complexe dans ce projet.

Réduction

Le nombre estimé d'animaux utilisés dans ce projet a été défini à 3 primates répartis en 3 lots de 1. Il a été réduit au minimum. La période de washout (periode d'elimination de l'organisme du candidat médicament) entre les deux phases permet de réutiliser 2 animaux pour l’évaluation des doses répétées ce qui permet de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Afin d'optimiser leur bien-être et de leur permettre d'exprimer leurs besoins comportementaux, les animaux sont hébergés en groupes sociaux de même sexe. De l'eau fraîche ad libitum est mise à leur disposition et un aliment adapté à l'espèce et au poids de chaque individu est distribué quotidiennement. Les paramètres environnementaux de l'animalerie sont également suivis et contrôlés afin de répondre aux exigences physiologiques de l’espèce. En parallèle, un programme d'enrichissement complet est mis en place au sein de l'animalerie. Ce dernier comprend : - Des enrichissements structuraux permettant aux PNH d'évoluer dans un environnement tridimensionnel ; - De la litière pour leur permettre de fourrager ; - Des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine pour éviter que les animaux ne se lassent ; - Des friandises et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement ; - De la musique d'ambiance est diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Une période d'acclimatation sera mise en place avant le début de l’étude. Un programme d'habituation à l'Homme et de conditionnement aux actes techniques associés à du renforcement positif permettra de réduire le stress des animaux lié aux manipulations (prise de sang, de température rectale, chaise à contention). Les animaux seront suivis individuellement et bi-quotidiennement tout au long de l'étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur. De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal afin de diminuer le stress qui pourrait être engendré par les manipulations. Les temps de repos accordés aux animaux entre les prélèvements et les volumes prélevés respecteront les recommandations éthiques en vigueur. Des mesures préventives et correctives de diminution de la douleur et du stress ont été déterminées au préalable sans compromettre les objectifs scientifiques de l’étude. Durant les administrations, les animaux seront assis sur des chaises à contention. Pour limiter leur stress et l’ennui, un personnel formé veillera à interagir avec les animaux, leur distribuer des friandises ou encore leur projeter un documentaire/dessin animé sur une tablette électronique. Des points limites précoces et spécifiques ont été définis et seront utilisés en cas de besoin.

Choix des espèces

La molécule d’intérêt étudiée dans ce projet étant à visée humaine, il est important d'avoir recours à un modèle animal pertinent et prédictif. En raison de sa proximité phylogénétique et physiologique avec l'Homme, notamment en ce qui concerne les populations de lymphocytes T γδ et l'expression des cibles impliquées dans le mécanisme d'action du candidat médicament, le macaque a été retenu dans le cadre de ce projet. L’anticorps cible des récepteurs présents chez le macaque mais absents ou très différentes chez les rongeurs. En effet les rongeurs ne possèdent pas de système γδ comparable à celui de l'Homme. Des jeunes adultes seront utilisés dans ce projet car certaines études montrent que les animaux matures (>4,5ans) sont statistiquement plus sujet aux anomalies liées au vieillissement pouvant affecter la qualité des échantillons prélevés et notamment les analyses histologiques.

Treize écouvillonnages du nez et de la trachée, cinq lavages des bronches, deux ponctions de moelle osseuse et jusqu'à six prises de sang par semaine : 246 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 216 d'entre eux sont infectés par la grippe puis par un pneumocoque et seront tués pour analyse des tissus, les 30 autres pouvant être réutilisés dans d'autres études après récupération et avis vétérinaire. Le porteur décrit une ponction lombaire par macaque, pouvant provoquer un hématome sous-cutané et aller jusqu'à l'hémorragie intrarachidienne ou intramédullaire, et un hébergement individuel pendant la phase d'infection. Le choix de cette espèce tient, selon lui, à la proximité génétique et physiologique avec l'être humain, à un appareil respiratoire de structure et de dimensions voisines et à un système immunitaire qui réagit de façon similaire.

Objectifs

La grippe constitue un enjeu majeur de santé publique. Des complications sévères peuvent survenir notamment lorsque l’infection par le virus de la grippe est suivie d’une infection bactérienne, appelée « surinfection ». Dans ce cas, les défenses naturelles des poumons sont affaiblies par le virus, ce qui permet à certaines bactéries opportunistes de s’installer plus facilement et d’aggraver la maladie. L’une des bactéries les plus souvent impliquées est Streptococcus pneumoniae, responsable notamment de pneumonies. Les surinfections bactériennes surviennent le plus souvent chez les personnes les plus fragiles, comme celles hospitalisées pour une grippe sévère, les patients en réanimation ou ceux ayant déjà d’autres problèmes de santé. Dans ces situations, la combinaison du virus et des bactéries peut entraîner des formes graves de maladie, avec un risque accru de complications voire de décès. Ce projet cherche à réduire ces complications. L’objectif est d’évaluer la sécurité et l’efficacité de nouveaux traitements limitant la gravité de la maladie lorsque virus et bactéries sont présents en même temps.

Bénéfices attendus

Aujourd’hui, certaines bactéries, comme Streptococcus pneumoniae, deviennent de plus en plus difficiles à traiter, car elles résistent aux antibiotiques habituellement utilisés, ce qui rend les infections plus difficiles à traiter. Ce projet vise à évaluer de nouveaux traitements innovants pour lutter contre les infections à Streptococcus pneumoniae. Les résultats, obtenus dans un modèle animal proche de l’humain, fourniront des connaissances essentielles pour mieux comprendre ces infections et développer de nouveaux traitements. Ils permettront également de proposer des solutions plus efficaces aux patients et d’améliorer globalement leur prise en charge. Ce projet pourrait contribuer à mieux protéger la santé humaine face à un problème de plus en plus préoccupant à l’échelle mondiale : la résistance aux antibiotiques.

Procédures

Les interventions prévues dans ce projet seront réalisées sous anesthésie générale et seront regroupés pour limiter les anesthésies (1 à 7x par semaine, 246 animaux, 30-45 minutes) : Prélèvements : - Prélèvements sanguins (1 à 6 10 fois par semaine, 246 animaux, 5 minutes). - Ecouvillonnages nasaux et trachéaux (13 fois, 246 animaux, 2 minutes) - Retrait de ganglions lymphatiques, (2 fois maximum, 216 animaux, 20 minutes) - Lavage broncho-alvéolaire (5 fois, 246 animaux, 10 minutes) - Ponction lombaire (1 fois, 216 animaux, 20min) - Moëlle osseuse (2 fois, 246 animaux, 10 minutes) Interventions - Implantation d’une puce de suivi de température (1 fois, 246 animaux, 30 minutes) - Infection par voie respiratoire, (2 fois, 216 animaux, 30 min) - Imagerie in vivo (5 fois, 246 animaux, 45 minutes) - Traitements avec des molécules thérapeutiques (jusqu’à 6 fois, 120 animaux, 5 minutes)

Impact sur les animaux

Les prélèvements et anesthésies répétés peuvent engendrer une perte d’appétit avec plus ou moins de perte de poids mineure, un hématome au niveau du site du prélèvement ou uneinfection au niveau du site de prélèvement dans les jours qui suivent le prélèvement. Après traitement, une réaction locale, des démangeaisons/douleurs dans les heures/jours suivant peuvent apparaitre. L’infection grippale peut causer de la fièvre, de la toux et un encombrement bronchique. Ces symptômes peuvent être augmentés par la surinfection par pneumocoque. L’état des animaux sera observé tous les jours et des points limites sont prévus dans le projet en cas de progression de la maladie ou d’éventuels effets inattendus du traitement. L’implantation de puces de télémétrie peut créer une réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie (rare), démangeaisons Les lavages bronchoalvéolaires, peuvent provoquer une toux, ou des difficultés respiratoires légères juste après le geste Les écouvillonnages nasotrachéaux peuvent provoquer un saignement nasal (léger à modéré) Le retrait de ganglions peut engendrer une réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie rare, durée de 1 à 5 jours l’hébergement individuel peut entrainer un stress ou de l’ennui. La ponction lombaire peut amener à un hématome sous-cutané, pouvant aller jusqu’à l’hémorragie intrarachidienne ou intramédullaire.

Devenir

Tous les animaux infectés seront euthanasiés afin de réaliser des dosages et une analyse des tissus. Les autres animaux pourront être inclus dans d’autres études après récupération complète des animaux et sur avis favorable du vétérinaire.

Remplacement

Ce projet a pour objectif d’évaluer la sécurité et l’efficacité de nouvelles stratégies de traitements contre des infections respiratoires complexes associant le virus de la grippe et Streptococcus pneumoniae. À ce jour, les méthodes alternatives telles que les études menées sur des cellules en laboratoire (approches in vitro), sur des modèles informatiques (in silico), ou encore sur des tissus isolés (ex vivo) ne permettent pas de reproduire toute la complexité anatomique du poumon humain, notamment les interactions entre les différents types de cellules et tissus, et le fonctionnement du système immunitaire dans son ensemble. C’est pourquoi, malgré les efforts pour privilégier ces alternatives, l’utilisation de modèles animaux reste nécessaire pour atteindre les objectifs du projet. Ce modèle animal permet de reproduire la complexité de l’ensemble des mécanismes biologiques impliqués dans cette double infection et d’évaluer de façon fiable la sécurité et l’efficacité de nouveaux traitements avant toute application chez l’humain.

Réduction

Dans ce projet, plusieurs mesures sont mises en place pour utiliser le moins d’animaux possible tout en garantissant des résultats fiables. Les premières étapes du projet serviront à ajuster les conditions d’infection les plus pertinentes (par exemple la quantité de bactérie utilisée) afin de reproduire de façon la plus fiable les symptômes observés chez l’humain sans multiplier les essais et selon un procédé, étape par étape, déjà publié dans la littérature scientifique. Pour affiner les paramètres importants comme la sécurité, la dose ou la manière d’administrer les traitements, seuls de petits groupes d’animaux seront utilisés. Cela permettra de sélectionner les meilleures conditions avant de passer à des études d’efficacité. Enfin, pour les études d’efficacité, le nombre d’animaux par groupe est strictement limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats solides et interprétables. Ce nombre a été déterminé de façon à pouvoir détecter de réelles différences entre les groupes tout en évitant d’utiliser plus d’animaux que nécessaire.

Raffinement

Les prélèvements et interventions sur les animaux sont réduits au minimum nécessaire pour répondre aux objectifs du projet. Ils seront effectués sous anesthésie générale pour éviter le stress et d’éventuelles douleurs et seront regroupés au maximum lors d’une même anesthésie afin de réduire le nombre d’anesthésies. Les anesthésies pouvant entrainer une diminution de l’appétit, une diversification et complémentation de l’alimentation sera instaurée au besoin. L’état général des animaux sera observé quotidiennement. À chaque intervention, l’état de santé des animaux sera évalué à l’aide d’une grille d’observation. Si des signes de maladie apparaissent, le vétérinaire sera immédiatement prévenu afin d’adapter le suivi et les soins. Le recours à des médicaments anti-douleur pourra être envisagé si nécessaire. Les points limites seront raffinés en fonction des résultats obtenus au cours de la mise en place du modèle. Les prélèvements de sang et les biopsies pouvant entrainer l’apparition d’une réaction locale, un traitement symptomatique pourra être mis en place (désinfection, analgésie locale). Pour limiter l’irritation de la trachée liée à l’intubation lors du lavage pulmonaire, un spray anesthésique sera appliqué localement en amont de la manipulation. L’implantation de puces électroniques, permettant un suivi régulier de la température corporelle, peut induire une réaction au site d’incision. Un signalement au vétérinaire sera effectué qui pourra appliquer un traitement symptomatique (désinfection, analgésie locale). Un traitement analgésique sera appliqué avant la chirurgie. Les animaux seront hébergés en groupes avant infection et en hébergements individuels proches permettant des interactions sociales pendant la phase d’infection (conservation du contact sensoriel, et hébergements face à face séparés par 2 m). Le programme d’enrichissement sera étendu par ajout de dispositifs alimentaires, jouets, renforcement du contact positif. Cet hébergement individuel est nécessaire pour éviter les biais lors de l’évaluation de la température mesurée par puce électronique, pour éviter une contamination croisée et limiter le stress lié à la cohabitation d’animaux développant la maladie

Choix des espèces

Dans ce projet, le modèle primate non-humain est choisi pour sa proximité génétique, et physiologique avec l'être humain, ce qui en fait le modèle le plus pertinent pour l’évaluation de traitements. Son appareil respiratoire ressemble beaucoup à celui de l’être humain, aussi bien par sa structure que par ses dimensions. Son système immunitaire réagit de manière similaire, avec une sensibilité aux mêmes types d’infections. De plus, les techniques et outils d’exploration de la réponse immunitaire sont disponibles et maitrisés chez cette espèce. Ces études seront réalisées sur des animaux adultes. Le traitement à tester étant destiné principalement à la population adulte et le système immunitaire évoluant en fonction du stade de développement et de l’âge des individus, des animaux au système immunitaire mature seront donc utilisés dans ce projet.

Chacune des 96 femelles macaques à longue queue utilisées est anesthésiée une quarantaine de fois, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. S'y ajoutent, par macaque, une infection vaginale par Chlamydia trachomatis, une à six injections de vaccin ou de placebo, l'implantation d'une puce de télémétrie, une quarantaine de prélèvements de sang, une trentaine d'écouvillonnages vaginaux, quinze biopsies vaginales et sept biopsies ganglionnaires. Le porteur attend des diarrhées, un amaigrissement, une cervicite avec écoulement purulent, une anémie transitoire et des infections cutanées aux sites de prélèvement, et prévoit des phases d'hébergement individuel dont il reconnaît qu'elles peuvent provoquer stress et ennui. Cinquante-deux macaques seront tuées pour analyse des organes cibles de l'infection, les quarante-quatre autres gardées en vie et réutilisées après vérification de leur état sanitaire par le vétérinaire.

Objectifs

Ce projet vise à mieux comprendre une infection sexuellement transmissible fréquente causée par la bactérie Chlamydia trachomatis, et à tester de nouvelles stratégies de vaccination pour essayer de la prévenir. Cette infection est très répandue dans le monde. Elle passe souvent inaperçue, en particulier chez les femmes, car elle ne provoque pas toujours de symptômes. Pourtant, elle peut avoir des conséquences graves, notamment sur la fertilité, en augmentant le risque de douleurs chroniques, de grossesse extra-utérine ou d’infertilité. Les traitements antibiotiques permettent de soigner l’infection, mais ils ne suffisent pas toujours à empêcher la propagation de l’infection dans la population ni à éviter certaines complications. Le développement d’un vaccin pourrait donc représenter un progrès important pour la santé publique. Le projet a pour objectif de mieux comprendre la manière dont cette infection se développe dans l’organisme et d’évaluer de nouveaux vaccins potentiels. Les nouveaux modèles d’infection développés dans ce projet permettront d’étudier une situation plus proche de celle observée chez l’être humain. Les candidats vaccins ayant montré des résultats satisfaisants chez le primate non humain pourront ensuite faire l’objet d’évaluations complémentaires en vue d’un possible développement clinique chez l’être humain. À plus long terme, ces travaux pourraient contribuer au développement de nouvelles approches de prévention pour réduire les conséquences de cette infection dans la population.

Bénéfices attendus

Le modèle d’infection développé dans ce projet aidera à mieux comprendre comment la bactérie Chlamydia trachomatis infecte l’organisme et s’y développe. Il permettra de disposer d’un outil proche de ce qui se passe chez l’être humain pour tester de futurs vaccins. Les candidats vaccins les plus prometteurs, après des résultats encourageants chez l’animal évalué au cours de ce projet, pourraient ensuite être utilisés chez l’être humain. À plus long terme, ces recherches pourraient contribuer à développer de nouvelles méthodes de prévention contre cette infection, avec pour objectif de réduire ses effets sur la santé publique

Procédures

Les interventions seront réalisées sous anesthésie générale (40 fois environ , entre 5 et 30 minutes sur tous les animaux) Les différentes interventions dans ce projet sont : - Injection des vaccins ou placebo (1 à 6 fois, tous les groupes vaccinés et contrôles, 5 min) - Infection vaginale avec la bactérie Chlamydia trachomatis (1 fois, tous les animaux, 15 min) - Prélèvement de sang (40 fois environ, tous les animaux, 5min) - Ecouvillonnage vaginal (30 fois environ, tous les animaux, 5 min) - Implantation d’une puce de télémétrie (1 fois, tous les animaux, 20 min) - Biopsies ganglionnaires (7 fois environ, 20 minutes, tous les animaux) - Biopsies vaginales (15 fois environ, 20 minutes, tous les animaux)

Impact sur les animaux

Dans ce projet, des nuisances ou effets indésirables pourront être observés selon les interventions : Nuisances liées aux vaccinations et aux biopsies (peu attendues) : Réaction locale, démangeaisons/douleur dans les heures/jours suivant l’administration ou les prélèvements. Nuisances liées à l’infection : diarrhée, amaigrissement, cervicite avec écoulement purulent (peu attendus). Nuisances liées aux anesthésies et prélèvements de sang : troubles de l’appétit avec plus ou moins de pertes de poids mineures, anémie transitoire (légère à modérée), hématome au niveau du site du prélèvement, infection cutanée dans les jours qui suivent le prélèvement. Nuisances liées à l’implantation de puces de télémétrie : réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie (rare), démangeaisons, durée de 1 à 5 jours. Nuisances liées à l’hébergement individuel : l’hébergement individuel peut entrainer un stress ou de l’ennui.

Devenir

En fonction des résultats obtenus, certains animaux pourront être euthanasiés à la fin de la procédure pour des analyses plus approfondies des organes cibles de l’infection. Les autres animaux seront gardés en vie à la fin de l’étude et réutilisés une fois que l’état sanitaire des animaux aura été vérifié par le vétérinaire compétent.

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, l’utilisation de l’animal de laboratoire est nécessaire pour mimer la pathologie observée chez l’être humain suite à l’infection par Chlamydia trachomatis. En effet, ce modèle animal permet de reproduire la réponse immunitaire induite par la vaccination et par l’infection dans un organisme entier, ce qui n’est pas réalisable avec les modèles ne recourant pas à l’animal de laboratoire (in vitro, in silico et ex vivo). Le primate non humain étant proche physiologiquement de l’être humain, son utilisation permet une meilleure extrapolation des résultats chez celui-ci.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum nécessaire à une analyse statistique fiable des résultats. Il a été ajusté au strict minimum nécessaire pour permettre une interprétation robuste des effets des conditions expérimentales, tout en prenant en compte la variabilité entre individus.

Raffinement

Les animaux seront suivis tous les jours, par une équipe dédiée. En cas d’atteinte d’un point limite, des mesures seront prises (arrêt des interventions, traitement, sortie d’étude), selon avis du vétérinaire et de la structure chargée du bien-être animal. En cas d’apparition de douleurs ou de signes cliniques liés aux prélèvements ou à l’infection, un traitement symptomatique pourra être mis en place. L’ensemble des interventions et les prélèvements seront regroupés au maximum et réalisés sous anesthésie générale des animaux. Les prélèvements sanguins, l’implantation de puces de télémétrie ou l’administration de vaccins peuvent entraîner des réactions locales (douleur, gonflement ou irritation). Si nécessaire, des soins appropriés, tels qu’une désinfection et un traitement contre la douleur, seront mis en place sur avis vétérinaire. Des phases d’hébergements en individuel seront nécessaires au cours du projet. Cet hébergement individuel pourrait entrainer un stress qui sera compensé par un programme défini par la cellule « bien-être animal » de l’établissement pour l’enrichissement de leur milieu de vie (distribution 2 fois/semaine d’enrichissements destructibles ou sachet surprise au lieu d’1 pour les hébergements en groupe). Cet hébergement individuel est nécessaire pour l’évaluation de certains paramètres biologiques notamment la température corporelle et pour limiter la surexposition bactérienne.

Choix des espèces

Seuls les primates non humains présentent des caractéristiques anatomiques et biologiques en termes de réponse immunitaire et vaccinale suffisamment proches de l’être humain pour permettre une étude pertinente de l’infection par Chlamydia trachomatis et de l’immunité. Nous avons choisi le macaque cynomolgus, modèle d’infection pour la bactérie d’intérêt déjà utilisé dans des études scientifiques précédentes et chez qui les techniques et outils d’exploration du système immunitaire sont disponibles et maitrisés. Notre étude, qui s’intéresse à l’infection vaginale par Chlamydia trachomatis nécessite d’avoir accès à des femelles adultes et matures.

Deux applications quotidiennes d'une crème inflammatoire sur le dos pendant quatorze jours, chacune avec dix à quinze minutes de contention, puis au quinzième jour une injection intraveineuse de trente minutes sur chaise de contention pendant une quarantaine de minutes : 20 macaques à longue queue vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. S'y ajoutent quatre prélèvements de sang de 2,5 ml, dix millilitres au total sur trois semaines, et quatre biopsies de peau par macaque sous anesthésie générale, précédées d'un jeûne pouvant aller jusqu'à seize heures. Le porteur attend des lésions cutanées, une fièvre par relargage de cytokines et des hématomes, signale qu'une déhiscence de plaie ou une infection du site de biopsie restent possibles, et projette un documentaire ou un dessin animé sur tablette pendant les contentions pour limiter l'ennui. Tous sont tués à la fin du projet pour que leurs organes soient récoltés.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de reproduire une réaction inflammatoire de la peau chez le macaque, similaire à celle observée chez l’Homme dans certaines maladies auto-immunes comme le psoriasis. Pour cela, une crème contenant un principe actif est appliquée sur la peau. Cette substance stimule le système immunitaire local et provoque une inflammation visible, avec des rougeurs, un épaississement de la peau et une infiltration de cellules immunitaires. Ce modèle permettra de tester l’efficacité d’un nouveau traitement. Ce traitement est un anticorps qui cible un type particulier de cellules immunitaires impliquées dans plusieurs maladies auto-immunes tel que le psoriasis. Au cours de l’étude, des échantillons de peau et de sang seront prélevés afin d’analyser les réactions de l’organisme, notamment au niveau de l’expression des gènes. Cela permettra de vérifier si le traitement agit comme attendu sur l’inflammation. Ce modèle a été développé en collaboration avec un partenaire scientifique afin de garantir sa pertinence. Les résultats obtenus pourraient contribuer, à terme, au développement de nouveaux traitements pour des maladies auto-immunes telles que le psoriasis, la polyarthrite rhumatoïde, les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin ou la sclérose en plaques.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d’évaluer l’efficacité d’un nouveau traitement basé sur un anticorps ciblant un type spécifique de cellules du système immunitaire, connues pour jouer un rôle important dans plusieurs maladies auto-immunes. L’étude permettra de vérifier si ce traitement est capable de réduire l’inflammation dans un modèle expérimental reproduisant certaines caractéristiques des maladies humaines. Les résultats obtenus permettront de mieux comprendre l’action de cet anticorps et de confirmer son intérêt comme approche thérapeutique. À plus long terme, ce projet pourrait contribuer au développement de nouveaux traitements pour des maladies auto-immunes, comme le psoriasis, la polyarthrite rhumatoïde, les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin ou la sclérose en plaques, avec l’objectif d’améliorer la prise en charge des patients grâce à des thérapies plus ciblées et adaptées.

Procédures

Au cours de ce projet, les animaux vigiles auront une application de crème sur une petite surface du dos identifiée, deux fois par jour pendant 14 jour. L’application de la crème et la contention durera environ 10 à 15 minutes. Cette contention pour l’application de la crème permettra également de faire une observation dermatologique rapprochée quotidienne du site d’application. Au 15ème jour, le modèle inflammatoire sera effectif, nous n’appliquerons plus de crème, et les animaux vigiles recevront un candidat médicament ou un contrôle par voie intra-veineuse de façon unique à différentes dose (contrôle, faible, moyenne, haute). L’injection durera 30 minutes et la contention sur chaise durera environ 40 minutes. Les animaux auront également 4 prélèvements de sang de 2,5ml, pour un volume total prélevé de 10 ml sur 3 semaines avant et après administration de l’élément d’essais. Les animaux seront vigiles lors des prélèvements de sang uniquement les jours sans biopsie de peau. Les jours de biopsie, les animaux seront anesthésiés, les prélèvements de sang se feront donc à ce moment-là. Chaque prélèvement dure entre 3 à 15 minutes (contention et prélèvement compris). Quatre prélèvements de peau par animal seront réalisés avant et après administration de l’élément d’essais, chez tous les animaux et sous anesthésie générale et analgésie (après une mise à jeun inférieur à 16h). Pendant cette anesthésie, des mesures spécifiques dermatologiques : plie de peau et taux de perte d’eau transépithéliale seront mesurés de manière non invasive avec des appareils de mesure spécifiques par un vétérinaire spécialisé. Le prélèvement durera environ 30 minutes (anesthésie et mesures comprises). Le suivi des paramètres physiologique (température et poids) tout au long du projet nécessitera une contention d’environ 5 minutes. Pour le confort des animaux, certains prélèvements et suivis pourront être réalisés simultanément (ce qui diminuera le nombre de manipulations et de contentions). Des points limites précoces ont été déterminés afin de prendre en charge toute forme de douleur ou de souffrance. En cas d’atteinte d’un de ces points, l’animal concerné sera pris en charge selon les recommandations du vétérinaire.

Impact sur les animaux

Sur la base du mode d’action du principe actif contenu dans la crème et de sa cible cutanée, des lésions au niveau de la peau pourront être observées. Sur la base du mode d’action des anticorps et de leur potentielle cible sur le système immunitaire, une réaction systémique de type fièvre peut apparaître les jours suivant les administrations liées à un relargage de cytokines. La réalisation de prélèvements sanguins et les administrations par voie intraveineuse pourront également provoquer un stress, une douleur légère et/ou l’apparition de réactions locales (du type hématome ou œdème léger par exemple) au niveau de la zone de ponction ou d’injection. Les prélèvements de peau sous anesthésie pourront provoquer des douleurs au niveau de la zone de prélèvement ainsi qu’un hématome et dans de très rare cas une déhiscence de plaie ou infection de la zone de prélèvement. L'anesthésie des animaux pourra également engendrer un stress ou une sensation d'inconfort lié à la mise à jeun (maximum 16h), à la procédure d'induction (contention, administration, perte de conscience...) ou lié au réveil de l'animal (risque de vomissements, perte d'équilibre...). Durant les administrations, les animaux seront placés sur des chaises à contention ce qui a pour conséquence de réduire leurs mouvements. Les animaux auront accès à de l’eau et des friandises durant la manipulation.

Devenir

À la fin du projet, tous les animaux seront mis à mort dans le but de récolter les organes pour évaluer l’efficacité de l’élément d’essais.

Remplacement

Le modèle d’inflammation cutanée vise à reproduire une réponse inflammatoire cutanée complexe, impliquant des interactions immunitaires proches de celles observées chez l’homme. Ces caractéristiques sont essentielles pour garantir la pertinence des résultats et la prédictivité des réponses thérapeutiques. Bien que des modèles de peau in vitro permettent d’étudier certains mécanismes cellulaires, ils restent limités dans la reproduction de la complexité immunologique, vasculaire et systémique observée in vivo. À ce jour, aucune méthode alternative in vitro ou in silico ne permet de capturer de manière fiable cette dynamique intégrée. La cible de l’anticorps est conservée chez le macaque et présente des caractéristiques fonctionnelles et phénotypiques proches de celles observées chez l’Homme, justifiant le choix de cette espèce. L’utilisation des animaux demeure donc indispensable pour valider le modèle et assurer la transposabilité des données vers la clinique dans le cadre du développement de nouvelles thérapies.

Réduction

Le nombre d’animaux a été strictement limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiquement exploitables. Un effectif de 5 animaux par groupe a été retenu afin de permettre la réalisation d’analyses robustes, tout en évitant une utilisation excessive d’animaux. Le design expérimental comprend 4 groupes (un groupe contrôle et trois groupes recevant des doses croissantes), permettant d’évaluer la relation dose-effet ainsi que de recueillir des données de pharmacocinétique au sein d’une même étude, limitant ainsi le recours à des expériences supplémentaires. Par ailleurs, le choix de cet effectif prend en compte la variabilité interindividuelle et génétique observée chez le macaque. Des études préliminaires menées sur un nombre restreint d’animaux ont mis en évidence plusieurs profils de réponse distincts à l’induction inflammatoire. L’augmentation du nombre d’animaux par groupe est donc nécessaire pour garantir la représentativité et l’homogénéité des groupes, tout en assurant la fiabilité de l’interprétation des résultats. Ainsi, le nombre total de 20 animaux constitue un compromis raisonné entre la réduction du nombre d’animaux utilisés et les exigences scientifiques nécessaires à la validation de l’étude.

Raffinement

Afin d'optimiser leur bien-être et de leur permettre d'exprimer leurs besoins comportementaux, les animaux sont hébergés en groupes sociaux de même sexe. De l'eau fraîche ad libitum est mise à leur disposition et un aliment adapté à l'espèce et au poids de chaque individu est distribué quotidiennement. Les paramètres environnementaux de l'animalerie sont également suivis et contrôlés afin de répondre aux exigences physiologiques de l’espèce. En parallèle, un programme d'enrichissement complet est mis en place au sein de l'animalerie. Ce dernier comprend : - Des enrichissements structuraux permettant aux macaques d'évoluer dans un environnement tridimensionnel ; - De la litière pour leur permettre de fourrager ; - Des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine pour éviter que les animaux ne se lassent ; - Des friandises et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs) ; - De la musique d'ambiance est diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Une période d'acclimatation sera mise en place avant le début de l’étude. Un programme d'habituation à l'Homme et de conditionnement aux actes techniques associés à du renforcement positif permettra de réduire le stress des animaux lié aux manipulations (prise de sang, application de la crème). Les animaux seront suivis individuellement et bi-quotidiennement tout au long de l'étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur. De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal afin de diminuer le stress qui pourrait être engendré par les manipulations. Les temps de repos accordés aux animaux entre les prélèvements et les volumes prélevés respecteront les recommandations éthiques en vigueur. Des mesures préventives et correctives de diminution de la douleur et du stress ont été déterminées au préalable sans compromettre les objectifs scientifiques de l’étude. Durant les administrations, les animaux seront assis sur des chaises à contention. Pour limiter leur stress et l’ennui, un personnel formé veillera à interagir avec les animaux, leur distribuer des friandises ou encore leur projeter un documentaire/dessin animé sur une tablette électronique par exemple.

Choix des espèces

L’utilisation du macaque pour le modèle d’inflammation cutané induit par l’application d'une crème contenant un principe actif sur la peau est justifiée par sa similarité immunologique avec l’humain. Les macaques ont un système immunitaire proche de celui de l’humain, notamment au niveau des voies de signalisation impliquées dans la réponse inflammatoire. Ce modèle induit une inflammation cutanée et une activation immunitaire locale. Chez le macaque, ces récepteurs sont exprimés de manière comparable à l’humain, ce qui garantit une réponse pharmacologique et immunologique pertinente pour l’évaluation des thérapies. La cible de l’anticorp est conservée chez le macaque et présente des caractéristiques fonctionnelles et phénotypiques proches de celles observées chez l’Homme, justifiant le choix de cette espèce. Des animaux juvéniles seront utilisés dans ce projet (jeunes adultes). Dans la littérature, certaines études montrent que les animaux matures (>4ans) sont statistiquement plus sujet aux anomalies liées au vieillissement pouvant affecter la qualité des échantillons prélevés et notamment les analyses histologiques. Sachant que des prélèvements de peau seront réalisés dans ce projet, il est préférable d’écarter au maximum ce biais lié à l’âge des animaux.

Sept macaques, quatre crabiers et trois rhésus, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour l'analyse post-mortem de leur cerveau. Ils subissent une restriction hydrique pendant douze à vingt-quatre mois, une chirurgie de pose d'implant crânien de quatre à six heures, parfois répétée sur l'autre hémisphère en cas d'infection, puis des séances quotidiennes d'enregistrement neuronal d'une à deux heures pendant six à huit mois. Le porteur liste les risques encourus : œdème cérébral, accident vasculaire lors de la descente des électrodes dans le cerveau, infection au site d'implantation. Le projet vise à créer chez le primate non humain un modèle de troubles compulsifs par inactivation de neurones du striatum, démarche que le porteur juge "indispensable" pour extrapoler aux aptitudes humaines.

Objectifs

Nous nous intéressons aux mécanismes neuronaux qui contrôlent l’adaptation du comportement de l'organisme aux contraintes changeantes de l’environnement (flexibilité comportementale). Plus précisément, nous étudions la contribution d'une région du cerveau appelée striatum, située sous le cortex cérébral, qui est censée intervenir dans la flexibilité comportementale. L’innervation cholinergique de cette région est altérée dans des pathologies neuropsychiatriques où prédominent des signes compulsifs (tics, stéréotypies, persévérations). La libération d’acétylcholine dans le striatum est assurée par un groupe spécifique d'interneurones cholinergiques (INChs) dont le dysfonctionnement est associé à un manque de flexibilité comportementale et à la manifestation de compulsions. Ainsi, une diminution de densité en INChs est décrite dans le striatum de patients atteints du syndrome de Gilles de la Tourette et des études chez le rongeur indiquent que l'inactivation des INChs perturbe l'adaptation des animaux à des changements de contexte. Les informations traitées par le striatum sont transmises aux circuits de commande du comportement par les neurones de projection qui influencent les commandes comportementales. L'adaptation comportementale résulterait de la mise en jeu coordonnée de ces neurones, sous contrôle des INChs. Les connaissances acquises chez le rongeur ne permettent pas de déterminer comment les INChs exercent ce contrôle. Notre projet vise à (1) déterminer la connectivité entre des populations distinctes de neurones du striatum; (2) examiner les interactions fonctionnelles entre ces populations; (3) établir si l'inactivation sélective des INChs induit des signes compulsifs assimilables à ceux observés chez l'humain. Pour cela, nous utilisons des approches expérimentales innovantes de marquage de populations neuronales distinctes dans le striatum, d’enregistrements simultanés de ces populations neuronales et d’inactivation des INChs par un procédé de ciblage sélectif de ces interneurones par utilisation d'outils génétiques.

Bénéfices attendus

Les troubles compulsifs sont une cause majeure de handicap dans bon nombre de maladies neuropsychiatriques. A n’en pas douter, les progrès à venir dans la compréhension et le traitement de ces anomalies passeront par une meilleure connaissance des mécanismes neuronaux sous-jacents. Dans cette perspective, la piste d'une anomalie de la neuromodulation cholinergique au niveau du striatum, une région profonde du cerveau, est actuellement privilégiée. On suppose qu'un défaut du signal cholinergique perturbe les informations transmises par le striatum aux circuits de commande comportementale qui aboutirait à l'expression de conduites inadaptées. Notre projet vise à préciser les bases anatomiques et physiologiques de cette régulation. Un aspect innovant de notre projet est le développement d'une méthode d'inactivation sélective des interneurones du striatum à la source du signal cholinergique à l'aide d'outils génétiques. Cet aspect du projet offre la possibilité de créer un modèle de troubles compulsifs chez le primate non humain permettant d'appréhender précisément la signification fonctionnelle de ce signal. Cette recherche fondamentale ouvre des perspectives prometteuses pour de nouvelles thérapies chez l'humain destinées à compenser un contrôle cholinergique défaillant dans les troubles compulsifs.

Procédures

(1) Contrôle hydrique pendant toute la durée des expériences (12 à 24 mois). (2) Examen IRM d'environ 2 h. (3) chirurgie pour la pose d'un implant crânien sur un hémisphère cérébral, suivi éventuellement d'une seconde implantation sur l'autre hémisphère dans le cas d'un incident (infection et/ou inflammation) obligeant à retirer le premier implant). Ce type de chirurgie dure de 4 à 6 heures. (4) enregistrements de l'activité neuronale chez le singe effectuant une tâche instrumentale au cours de séances quotidiennes de 1 à 2 h pendant 6 à 8 mois (5) injections de vecteurs viraux sous anesthésie générale conformément à un plan d'injection défini sur la base de l'examen IRM et du repérage électrophysiologique. Selon le nombre de sites d'injection (striatum et/ou globus pallidus), les injections durent entre 2 et 3 heures.

Impact sur les animaux

1) la restriction hydrique; (2) la capture des animaux depuis leur site d’hébergement, leur transfert au laboratoire et la contention de la tête sont source de stress dans les premiers temps de ces manipulations; (3) l'anesthésie générale présente des risques d'incident cardiaque ou respiratoire; (4) la chirurgie crânienne présente des risques d'infection au site d'implantation ou d'oedème cérébral; (5) la descente d'électrodes ou de canules d'injection dans le cerveau présente des risques d'infection ou d'accident vasculaire cérébral; (6) le maintien à long terme d'un implant crânien présente des risques liés au développement d'une infection ou de réactions inflammatoires au site d'implantation.

Devenir

Notre projet implique une analyse post-mortem de la connectivité entre différents types de neurones striataux et une évaluation de l'expression d'un transgène (DREADD) dans les INChs. Chaque animal sera mis à mort à l'issue de la procédure expérimentale.

Remplacement

Nos recherches portent sur la contribution de l’innervation cholinergique du striatum dans la flexibilité comportementale. L’approche expérimentale consiste à décrire le schéma des connexions anatomiques au sein du striatum, à corréler des indices de la flexibilité comportementale à l’activité électrophysiologique et à examiner les conséquences d’une inactivation cholinergique sur le comportement. Une telle approche exclut toute alternative basée sur des modèles in vitro (tranches de tissu, cultures de cellules ou cellules dissociées) ou sur l’animal anesthésié. Les neurosciences computationnelles permettent d’élaborer des modèles utiles pour la compréhension des processus sensorimoteurs ou cognitifs. Ces modèles tirent parti des données neurophysiologiques, acquises chez l'animal comme chez l'humain, et fournissent des hypothèses de travail ou des cadres d'interprétation utiles pour guider la recherche, mais en aucun cas ils ne peuvent remplacer l'expérimentation. De plus, un modèle computationnel, aussi sophistiqué soit-il, est une approximation de la complexité neurobiologique susceptible d'être améliorée sur la base des nouvelles données acquises.

Réduction

Nous avons restreint autant que possible le nombre d'animaux impliqués dans le projet tout en restant compatible avec l'exigence d'analyses statistiques fiables. Pour cela, l'analyse électrophysiologique des populations neuronales du striatum sera faite chez les mêmes singes qui seront ensuite utilisés pour les injections de vecteurs viraux. Pour l’électrophysiologie, l'analyse porte sur des échantillons de neurones enregistrés lors de séances quotidiennes, pendant plusieurs mois. L'analyse est d'abord faite pour chaque animal et les données sont ensuite groupées. Ce "pooling" permet d'augmenter la puissance statistique, en particulier si les échantillons de neurones disponibles pour chaque animal sont trop faibles. Nous complétons cette analyse globale par une analyse cas par cas si les performances et les données neuronales divergent trop entre les sujets. Afin de réduire le nombre d’animaux pour étudier la connectivité entre neurones striataux, nous réaliserons les injections de vecteurs viraux dans les 2 hémisphères cérébraux de chaque singe. Comme les projections des neurones de sortie striataux vers le globus pallidus sont strictement ipsilatérales, on ne risque pas d'induire de chevauchement des marquages en intervenant sur chacun des hémisphères.

Raffinement

Tout est mis en oeuvre pour favoriser la coopérativité de l'animal dans les expériences de conditionnement, d'enregistrement et d'inactivation pharmacogénétique. Pour diminuer le stress des animaux au début de certaines phases de la procédure expérimentale (capture, contention de la tête), on les habitue progressivement aux contraintes imposées. A l'animalerie, les animaux sont hébergés en duo ou trio, selon les affinités, dans un environnement enrichi qui inclut l'accès à une volière munie d'objets à manipuler, de perchoirs et de cordages. Les interventions sources de douleur (implantation crânienne, injections intracérébrales, perfusion intracardiaque) sont effectuées sous anesthésie générale. Les chirurgies crâniennes sont suivies d'un traitement analgésique morphinique en période post-opératoire immédiate. Tout constat d'anomalie affectant l'état général de l'animal en cours d'expérience donnera lieu, sous anesthésie ou sédation profonde, à un examen complémentaire par le vétérinaire pour auscultation et/ou prélévements sanguins. Les éventuels épisodes inflammatoires ou infectieux au site d'implantation donneront lieu à des traitements locaux adaptés. Les points limites définis dans le cadre des différentes étapes de notre procédure expérimentale seront pris en considération pour décider de l'interruption de l'expérimentation afin de mettre en oeuvre une prise en charge thérapeutique adaptée, impliquant notamment le retrait du dispositif implanté, ou l'euthanasie de l'animal si son état s'est trop dégradé en dépit des soins.

Choix des espèces

L'analyse des anomalies comportementales après inactivation expérimentale chez le rongeur n'est jamais aussi détaillée que celle faite chez le singe. Les spécificités du répertoire comportemental des primates font du macaque rhésus un bon modèle pour l'expression de compulsions semblables à celles qui se manifestent chez l'humain. Une abondante littérature atteste de la similitude d’organisation des circuits qui relient le cortex préfrontal au striatum chez le macaque rhésus et l'humain. Il est donc indispensable d’étudier les supports neuronaux des fonctions de planification et de sélection de l'action chez le singe pour extrapoler aux aptitudes humaines et à leur dérèglement en pathologie. De plus, les tests comportementaux sont proches de ceux employés chez l'humain (mouvements d'atteinte de cibles avec la main) et les données électrophysiologiques recueillies à l’échelle neuronale chez le singe sont un complément précieux aux mesures plus globales, non invasives, de l'activité cérébrale chez l'humain. Nous utilisons des animaux dans une gamme de poids 6 à 12 kg dont la morphologie crânienne est compatible avec la mise en place chirurgicale de la chambre d'enregistrement et du dispositif de fixation de la tête.