Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 19/10/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-015356)
450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Différents vecteurs viraux dérivés de l’AAV9 leur sont injectés, dès le premier jour de vie pour une partie, par voie abdominale, intraveineuse ou derrière l’œil, avec un suivi hebdomadaire par bioluminescence. Le porteur reconnaît que l’injection derrière l’œil peut provoquer un gonflement de l’œil, une proptose ou une cécité, et que les anesthésies prolongées peuvent causer des troubles cognitifs. Il compare l’efficacité de ces vecteurs pour la thérapie génique musculaire et juge le recours à l' »organisme entier » nécessaire.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Les vecteurs viraux sont des outils largement utilisés en thérapie génique. Parmi eux, les virus adéno-associés (AAV) présentent de nombreux avantages comparés aux autres vecteurs car ils ne sont pas pathogènes chez l’Homme et présentent une faible immunogénicité ainsi qu’une grande stabilité génétique. Il existe plusieurs sérotypes d’AAV dont l’AAV9 présentant un tropisme pour les muscles. Une des limites de l’utilisation des AAV en tant que vecteur est le manque de spécificité. D’autres AAV dérivés de l’AAV9 décrit dans différentes publications présenteraient une augmentation de la spécificité musculaire en vitro et en in vivo. L’objectif du projet est donc de pouvoir comparer l’efficacité des différents dérivés de l’AAV9 avec l’AAV9 ainsi qu’entre eux chez la souris et par la suite de sélectionner celui qui montrera la meilleure optimisation de l’efficacité et la spécificité dans le muscle tout en limitant celle dans les autres organes. Le but final est d’améliorer la thérapie génique pour traiter les maladies génétiques du système musculaire.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
L’identification du meilleur sérotype d’AAV ciblant le plus spécifiquement les muscles et moins les autres organes permettra une meilleure efficacité des thérapies géniques applicables aux maladies musculaires.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
La cohorte « injections intrapéritonéales » seront soumises aux procédures suivantes : -Injection intrapéritonéale unique au premier jour post-natal, 1 minute par animal -Injection sous cutanée (1minute) de la substance émettrice de lumière chaque semaine à partir de la 2ème semaine de vie pour l’analyse en bioluminescence. La cohorte « injections intraveineuses » seront soumises aux procédures suivantes : – Injection intraveineuse (1 minute) unique par la veine caudale chez la souris éveillée -Injection sous cutanée (1 minute) de la substance émettrice de lumière chaque semaine à partir de la 2ème semaine de vie pour l’analyse en bioluminescence. La cohorte « injections rétro-orbitales » seront soumises aux procédures suivantes :- Injection rétro-orbitale (1 minute) unique chez la souris sous anesthésie -Injection sous cutanée (1 minute) de la substance émettrice de lumière chaque semaine à partir de la 2ème semaine de vie pour l’analyse en bioluminescence
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
L’injection peut provoquer chez l’animal un stress dû à l’acte, ainsi qu’une perte de poids. L’injection intrapéritonéale peut provoquer une douleur transitoire chez l’animal. Une anesthésie prolongée peut causer des troubles cognitifs chez l’animal. L’injection rétro-orbitale peut provoquer l’apparition de gonflement oculaire au site d’injection, une proptose ou encore une cécité. Une anesthésie prolongée peut causer des troubles cognitifs chez l’animal.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Notre projet nécessite la collection d’organes pour l’analyse au niveau histologique et moléculaire
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Ces analyses ne peuvent pas être remplacées par des tests in vitro sur des lignées cellulaires musculaires car celles-ci ne permettent pas l’étude de l’impact de l’AAV sur un organisme entier. En effet seul le modèle animal pourra nous permettre l’étude de la bio distribution d’un produit injecté. De plus, le modèle murin est physiologiquement assez proche de l’Homme, ce qui va nous permettre une étude représentative de l’efficacité et de la spécificité des différents vecteurs viraux.
2. Réduction
Le nombre d’animaux a été basé sur le nombre de virus et de doses à tester par âge. Ce nombre a été basée sur de précédentes études similaires et permet d’assurer une robustesse statistique nécessaire à l’interprétation des résultats. L’expérience de bioluminescence, qui est une expérience permettant de visualiser la localisation du virus dans l’animal, nous permet d’avoir un suivi hebdomadaire de l’expression du virus chez la souris, ce qui nous évite la création de plusieurs groupes de souris à différents âges.
3. Raffinement
Une alimentation enrichie en plus de l’alimentation inscrit dans l’agrément de l’EU sera mis en place si une perte de poids (inférieure à 22 grammes) est observée suite à l’injection des virus. Les animaux seront surveillés chaque semaine jusqu’à leur mise à mort. Si des difficultés de locomotion apparaissent lors de l’hébergement, de la nourriture en gel sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. De l’ocrygel sera appliqué dans l’ensemble des procédures expérimentales pour prévenir tout inconfort d’assèchement oculaire lors du réveil. Les point limites seront déterminés en fonction des observations faites d’une part pendant l’anesthésie (évaluation du rythme cardiaque, variation de la température de l’animal) et d’autre part pendant et après l’injection de l’animal (changement du comportement, réponses à des stimuli externes). L’anesthésie et la procédure d’injection seront arrêtés si ces points limites sont atteints.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Pour tester l’éventuelle amélioration de l’efficacité et de la spécificité du vecteur viral, nous avons besoin d’effectuer des expériences in vivo sur modèle animal. Des projets similaires sur ce modèle animal ont déjà été publié, l’utilisation de ce modèle s’inscrit donc dans un effort de continuité et de reproductibilité de nos études. Enfin, le modèle murin présente l’unique avantage d’être génétiquement très proche de l’homme et facile d’élevage en raison de sa taille et de ses capacités de reproduction. La cohorte concernant le groupe de souris qui seront injectées par voie intrapéritonéale utilisera des souris dès le premier jour de naissance. Cela permettra d’évaluer l’efficacité des virus pour mettre en place une stratégie de thérapie génique préventive. La cohorte concernant le groupe de souris qui seront injectées par voie intraveineuse utilisera des souris de 6 semaines d’âge. Cela permettra d’évaluer l’efficacité des virus pour mettre en place une stratégie de thérapie génique curative. A partir de la modification, La cohorte RO à P1 utilisera des souris dès le premier jour postnatal. Cela permettra d’évaluer l’efficacité de l’AAV pour mettre en place une stratégie de thérapie génique préventive. La cohorte RO à 6w utilisera des souris de 6 semaines d’âge. Cela permettra d’évaluer l’efficacité de l’AAV pour mettre en place une stratégie de thérapie génique curative. Le groupe de 10 souris pour l’apprentissage du geste RO à P1 utilisera des souris à P1.