Etude de la réponse inflammatoire dans les modèles d’Alzheimer

Les études d’analyse génomique concernant la maladie d’Alzheimer montrent l’influence de gènes intervenant dans la réponse immunitaire notamment ceux exprimés dans les cellules de la microglie. Afin de suivre cette réponse inflammatoire durant l’évolution de la maladie nous allons utiliser une souris reportrice HexdtTomato. Chez cette souris les cellules de la microglie expriment une protéine fluorescente (dtTomato) sous le contrôle de la sous-unité bêta du gène hexominidase (Hexb) facilitant la localisation et le suivie de ces cellules in vivo et ex vivo. Nous allons utiliser cette souris dans nos modèles de la maladie d’Alzheimer. Ainsi nous allons déterminer l’influence de 2 gènes d’intéret dans la réponse inflammatoire dans le modèle de souris APPSwe/Ind. La souris APP Swe/Ind exprime une forme humaine de la protéine APP (Amyloid Precusor Protein) porteuse de la mutation humaine Swedish/Indiana. Cette souris développe des plaques amyloïdes à partir de 8 mois. Nous travaillerons sur des animaux âgés de 2 à 4 mois et de 10-11 mois. Nous voulons déterminer comment évoluent les cellules de la microglie à des temps précoces de la maladie (2-4 mois) et à des temps où la maladie est installée soit 10-11 mois. Ainsi on pourra définir les rôles de nos deux gènes d’intérêt dans l’évolution de la réaction inflammatoire au sein du modèle APP Swe/Ind.

La mise en œuvre de ce projet provient des résultats des analyses génétiques réalisées sur des malades de la maladie d’Alzheimer. En effet de nombreux gènes liés au système immunitaire ont été retrouvés tel que Trem2. En travaillant sur 2 temps, on peut voir comment la réaction inflammatoire évolue aux cours du développement de la maladie d’Alzheimer. La réalisation de ce projet nous permettra de caractériser les différents types de microglie et nous permettra de définir la « bonne microglie » qui favoriserait la clairance et la dégradation des plaques amyloïdes.

En vue du génotypage des animaux, ces derniers doivent subir une biopsie de queue qui se fait sous anesthésie. Nombre 6900 fréquence une fois. Sur des animaux vigiles, nous effectuons des injections intrapéritonéales (nombre 600, fréquence 5, une fois par jour), intranasales ( nombre 800, fréquence 5 fois, une fois par jour ), intraveineuses ( nombre 800 fréquence une fois) et des gavages (nombre 600 fréquence une fois par jour pendant 30 jours ou une fois par jour pendant une semaine). Sur des animaux anesthésies avec un suivi postopératoire nous réalisons des injections intracérébrales (nombre 600 une fois Injection), injection dans la cisterna magna (nombre 200 une fois) et la pose d’une fenêtre crânienne (nombre 400 une fois). Sur des animaux anesthésiés nous les sacrifions après une perfusion intracardiaque (nombre 6900 une fois).

Les animaux sont suivis régulièrement. Les effets indésirables dans ce projet sont essentiellement pour les procédures qui impliquent un acte chirurgical soit les procédures 6-7-9. Un tableau de « scoring » a été établi pour suivre les animaux (tableau joint). La durée maximale avant le sacrifice est de 7 jours dans le cas de la procédure 7. La phase post opératoire est la suivante: – lors de la phase de réveil, l’animal est placé dans une cage sur du papier propre afin d’éviter des contacts entre la sciure et la suture, et sous une lampe chauffante pour éviter toute hypothermie due à l’anesthésie. Pour la réhydratation de l’animal on injecte du NaCl 0.9% glucosé à 5% (500µl). – lors du réveil, les animaux reviennent dans la salle d’hébergement. Des observations fréquentes sont réalisées (2 fois par jour sur une semaine) pour vérifier l’état de la suture. Pour réduire la douleur due à certaines procédures chirurgicales nous utilisons BUPREMORPHINE (0.1MG/KG, SC 100µL) ET KETOPROFENE (5MG/KG, SC 100µL) DEUX FOIS PAR JOUR DURANT 2 JOURS. Les animaux reçoivent une nourriture humide et du Diet Boost gel pour récupérer son poids initial. -Si la perte de poids de l’animal dépasse 15% il est euthanasié. Si les animaux présentent une activité absente, une immobilité et des déplacements difficiles dans les 24 heures postopératoire, l’animal est sacrifié.

L’ensemble de nos procédures se terminent par le sacrifice des animaux et par la réalisation de la procédure 8. En effet nous devons prélever le cerveau ce qui implique le sacrifice de l’animal pour déterminer le nombre de plaques amyloïdes, réaliser des dosages d’Abeta42, suivre l’activité de certaines enzymes intervenant dans le métabolisme de la protéine précurseur de l’amyloïde (APP).

Dans cette espèce différents outils génétiques existent : des souris transgéniques, KO, KI permettant de réaliser des études dans des conditions physiologiques. Nous disposons donc de modèle qui développe la maladie d’Alzheimer mais également de souris reportrice nous permettant de suivre des cellules de la microglie par l’expression d’une protéine fluorescente la protéine tomato. Ainsi en utilisant ces souris nous pouvons suivre le développement de la réaction inflammatoire lors de l’établissement de la maladie d’Alzheimer. Pour cela nous travaillerons à deux temps, un temps précoce 2-4 mois et un temps plus tardif où la maladie est installée soit 10-11 mois. Au stade 10-11 mois nous pouvons observer des plaques amyloïdes dans le cerveau des souris. Grace à la souris reportrice HexdtTomato, nous pourrons déterminer le rôle de la microglie dans la formation de ces plaques (taille, forme, …).