Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 18/07/2024
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-049685)
Confirmer in vivo des observations déjà obtenues in vitro, parce que les rapporteurs des revues le réclament systématiquement à la publication : 1 050 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune reçoit deux injections intrapéritonéales d’hormones à quarante-huit heures d’intervalle, puis est mise à mort au plus tard vingt-quatre heures après la seconde pour disséquer les ovaires et les oviductes et récolter les ovocytes. Le porteur compte environ vingt-cinq ovocytes par femelle et une souris par lot d’expérience, soit 210 souris par an sur cinq ans. Il indique privilégier la maturation in vitro, qui donne davantage d’ovocytes, et recourir par ailleurs à la levure et au xénope pour certaines questions.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Le laboratoire étudie les mécanismes qui régulent la méiose dans l’ovocyte de souris. La méiose consiste en deux divisions successives conduisant à la formation des gamètes. En particulier, dans l’ovaire, les ovocytes sont immatures et sont arrêtés en début de méiose. Une stimulation hormonale induit la maturation méiotique et l’ovulation. Les ovocytes matures sont arrêtés en fin de méiose et sont ovulés dans l’oviducte où ils pourront potentiellement être fécondés par un spermatozoïde. Le plus souvent, au laboratoire, nous prélevons des ovocytes immatures dans l’ovaire et nous induisons la maturation méiotique des ovocytes in vitro afin d’obtenir des ovocytes matures. Cette stratégie nous permet de suivre les différentes étapes de la méiose mais a l’inconvénient de s’éloigner des conditions physiologiques in vivo. C’est pour cela, que nous avons besoin de confirmer certaines de nos observations dans des ovocytes matures in vivo, prélevés dans l’oviducte après ovulation. Cette stratégie nécessite de faire une hyperstimulation ovarienne des souris afin de stimuler la maturation des ovocytes et l’ovulation. La procédure décrite dans ce projet inclut : 1) l’hyperstimulation ovarienne par injection d’hormones sur des souris femelles 2) la mise à mort des souris injectées pour dissection des oviductes et collecte des ovocytes. Nous utilisons des souris non modifiées ou des souris génétiquement modifiées. Aucune des souris que nous utilisons ne présentent de phénotype dommageable. Dans tous les cas, les souris ne seront injectées que dans le but de stimuler la maturation des ovocytes et l’ovulation. Aucune manipulation autre que les injections d’hormones et mise à mort ne sera réalisée sur les souris.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Même si la maturation in vitro des ovocytes présente des avantages indéniables tels qu’une facilité de synchronisation, et l’accessibilité à toutes les étapes de la méiose, on ne peut pas exclure un effet de la culture in vitro sur différents aspects de la méiose que nous étudions. Les ovocytes matures in vivo après stimulation ovarienne sont de meilleure qualité et dans un état plus physiologique que les ovocytes qui ont maturé in vitro. Ainsi, la stimulation ovarienne nous permettrait de confirmer dans des ovocytes matures in vivo, les observations obtenues après maturation in vitro, afin d’exclure tout effet de la culture in vitro sur nos interprétations. Cette confirmation devient essentielle et est systématiquement réclamée par les rapporteurs lors de la publication de nos données.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les souris seront soumises à 2 injections intrapéritonéales à 48h d’intervalle. Elle seront systématiquement mises à mort maximum 24h après la 2e injection pour la dissection des ovaires et des oviductes. Aucun accouplement, et aucune gestation n’est prévu après les injections.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
L’injection intrapéritonéale d’hormones est une procédure légère. les effets indésirables sont: -le stress dû à la contention -la douleur induite par l’introduction de la seringue. En cas de signes de douleurs persistants comme la prostration de l’animal, l’animal sera immédiatement mis à mort. A noter qu’aucun accouplement ni gestation ne sera réalisé après la procédure de stimulation ovarienne, le but n’étant pas ici d’augmenter la taille de la portée.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux seront mis à mort à l’issu de la procédure car après stimulation ovarienne, les oviductes seront prélevés afin de collecter les ovocytes matures qui ont été ovulés.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
La méiose est spécifique des cellules germinales et peut être observée uniquement dans les gamètes (ovocytes ou spermatozoïdes). Pour étudier la méiose femelle, nous sommes donc obligés d’utiliser des ovocytes issus d’animaux car il n’existe pas de lignées cellulaires méiotiques. Nous utilisons la levure comme modèle alternatif non animal, et le xénope comme modèle non mammifère, pour adresser certaines questions spécifiques. Notamment les approches protéomiques qui nécessitent une quantité importante de protéines sont réalisées dans la levure. Cependant la maturation méiotique dans la levure est différente de celle des mammifères et certaines questions ne peuvent pas être étudiées dans la levure ou dans le xénope. Ainsi, certains de nos résultats nécessitent d’être confirmées dans un modèle animal plus proche de l’homme comme la souris.
2. Réduction
Afin de réduire le recours aux injections et de minimiser la souffrance des animaux, nous privilégions la maturation d’ovocytes in vitro, qui nous permet aussi d’obtenir une quantité plus importante d’ovocytes et de limiter le nombre de souris utilisées. Cette procédure de stimulation ovarienne ne sera utilisée que ponctuellement pour confirmer certaines observations et dépend donc des résultats obtenus préalablement in vitro. Le nombre de souris femelles nécessaire dépend du nombre d’ovocytes collectés/femelle. Le nombre moyen d’ovocytes/femelle collectés dans l’oviducte après stimulation ovarienne est de 25 ovocytes/femelle. Pour qu’une expérience soit interprétable, nous avons besoin d’environ 10-20 ovocytes/lot donc 1 souris/lot. Un lot correspond par exemple à un lot d’ovocytes contrôles, un lot d’ovocytes exprimant une mutation, ou un lot d’ovocytes traités avec un inhibiteur. Nos expériences incluent 2 à 4 lots donc 2 à 4 souris. Chaque expérience devant être répétée 4 fois, nous devront utiliser 8 à 16 souris par expérience. Le nombre d’expérience nécessitant cette procédure est variable et difficile à estimer. En se basant sur les expériences prévues pour l’année à venir, nous estimons avoir besoin de 192 souris (une douzaine d’expériences). 64 souris swiss, 64 souris C57Bl/6, 64 souris transgéniques. Après majoration de 10% pour palier aux éventuels échecs de la stimulation ovarienne, nous estimons avoir besoin de 210 souris/an. Pour réduire le nombre de souris, nous optimisons au maximum l’utilisation des ovocytes, en réalisant plusieurs expériences sur le même lot d’ovocytes (par exemple, une fixation sur ovocyte entier et un étalement chromosomique, ou plusieurs marquages protéiques). Les tests préalables aux expériences : efficacité des inhibiteurs, test de concentration des inhibiteurs, test d’anticorps, sont évidemment réalisés sur des ovocytes matures in vitro.
3. Raffinement
Seules les injections d’hormones peuvent affecter le bien-être des animaux et induire du stress lors de la contention. Cette procédure sera réalisée par un manipulateur expérimenté pour limiter ce stress et les souris injectées seront soumises à une surveillance accrue afin de détecter le moindre signe de douleur après l’injection comme la prostration. En cas de signe de douleur, l’animal sera immédiatement mis à mort.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris est un modèle mammifère qui est à la fois très proche de l’Homme et dont les gamètes sont facilement accessibles pour étudier la méiose. La maturation méiotique dans l’ovocyte est très similaire à celle de l’ovocyte humain, permettant d’extrapoler nos interprétations à l’Homme. Les souris femelles sont utilisées à l’âge adulte entre 8 et 12 semaines car c’est à cet âge qu’elles produisent le plus grand nombre d’ovocytes.