Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 12/04/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-076217)
7 020 animaux non-humains, 5 460 souris et 1 560 rats, vont être utilisés, tous tués à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les modèles, ils subissent une ligature chirurgicale du canal biliaire, des injections répétées de tétrachlorure de carbone ou d’autres composés, puis des traitements par de multiples voies pouvant aller jusqu’à deux administrations par jour, pour reproduire des maladies chroniques du foie. Le porteur affirme que ces maladies ne sont pas associées à une douleur chez l’humain et n’en attend donc pas chez l’animal, malgré l’induction d’inflammation et de fibrose hépatiques. Il conclut au caractère de « stricte nécessité » du modèle animal, jugé irremplaçable pour examiner l' »animal entier ».
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Les maladies hépatiques cholestatiques chroniques regroupent 2 formes majeurs chez l’adulte : la cholangite biliaire primitive (PBC) et la cholangite sclérosante primitive (PSC). Ce sont toutes les 2 des maladies rares qui endommagent les canaux biliaires entrainant une accumulation de bile au niveau du foie. Cette accumulation entraine de l’inflammation, de la fibrose et peut éventuellement mener à la cirrhose du foie et à une insuffisance hépatique. Concernant la PBC, seuls les canaux intra-hépatiques sont touchés alors que ce sont les canaux intra- et extra-hépatiques qui sont impactés par la PSC. Ces maladies sont asymptomatiques au stade précoce puis les personnes atteintes peuvent présenter un état de fatigue, du prurit, la jaunisse et un inconfort abdominal. L’estimation de la survie moyenne à partir du diagnostic de la maladie est de 15 à 20 ans. A ce jour, il n’existe qu’un seul traitement capable de traiter la PBC et approuvé par les autorités américaines: l’acide ursodesoxycholique (UCDA). Malheureusement, plus de 40% des patients traités n’y répondent pas et nécessitent l’ajout d’un traitement de 2eme intention (comme l’acide obéticholique) engendrant beaucoup de toxicité et d’effets secondaires. De plus, même après une transplantation hépatique de dernier recours, il y a une forte probabilité de récurrence de la maladie. En ce qui concerne la PSC, aucun traitement n’a encore été approuvé et il devient donc urgent de développer de nouveaux médicaments permettant de traiter et d’améliorer la qualité de vie des patients touchés par ces pathologies. Il est donc nécessaire de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques visant à découvrir ou repositionner des molécules et comprendre les mécanismes qui jouent un rôle dans la survenue et l’évolution de la maladie. Dans le cadre de nos programmes de maturation, nous développons au stade pré-clinique des nouvelles molécules pharmaceutiques ou des molécules en repositionnement. Pour chaque nouvelle molécule intégrée dans notre pipeline, des études de toxicologie, de pharmacocinétique et d’efficacité seront entreprises. Cette demande d’éthique concerne les études d’efficacité dans le contexte de maladies hépatique cholestatiques chroniques avec la mise en place de modèle animaux reproduisant ces pathologies chez la souris ou le rat. L’objectif est de trouver des molécules pouvant retarder la progression de la maladie et améliorer la qualité de vie des patients atteints par ces pathologies.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet en général se focalise sur l’étude et la validation, dans un contexte physiopathologique pertinent, de l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques ou de molécules déjà approuvées pour une autre indication pouvant avoir un effet dans les cholestases chroniques hépatiques. Les retombées attendues incluent le screening in vivo de molécules efficaces, l’étude si besoin de leur mécanisme d’action et l’évaluation des meilleurs candidats avant une éventuelle utilisation en clinique chez l’homme. Ainsi, nos études permettront de trouver potentiellement des médicaments dont les effets seraient supérieurs aux molécules de référence déjà existantes, qui ralentiraient la progression de la maladie évaluée par des analyses sanguines (marqueurs enzymatiques, anticorps) ou par analyse histologique (inflammation et fibrose du foie).
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Tous les animaux des groupes 2 à 7 subiront soit des injections systémiques toutes les 2 semaines de 2OA-BSA et 3 injections d’αGalCer (procédure 1), soit des injections systémiques 2 fois par semaine de tétrachlorure de carbone (procédure 3), soit une ligation du conduit biliaire par méthode chirurgicale (procédure 4) pour induire la pathologie. Les procédure 1 et 3 se feront sur animaux vigiles et de manières répétées tandis que pour la procédure 4, l’induction se fera chirurgicalement de manière unique sur animaux anesthésiés. Les animaux du groupe 1 quant à eux recevront de l’adjuvant de Freund et du sérum physiologique ou de l’huile de maïs ou opéré à blanc selon la procédure correspondante. Les traitements pourront être administrés en préventif (jusqu’à 1 mois avant l’induction du modèle) et/ou en curatif (jusqu’à 1 mois après l’induction du modèle). Selon la molécule, la voie d’administration pourra être par voie intra-veineuse, intra- péritonéale, sous-cutané, par voie orale, par voie topique sur animal vigile ou par système de mini-pompe osmotique (procédure 5). Tous les animaux recevront un véhicule, un traitement à tester ou une molécule de référence. Le nombre d’administration dépendra de la molécule et de la voie d’administration considérée. Cela pourra être une fois par semaine jusqu’à une à deux fois par jour. En amont des études in vivo, la toxicité potentielle des molécules testées et du véhicule aura été testée in vitro. Dans le cas où les molécules d’intérêt ne sont pas des molécules déjà sur le marché pour d’autres indications, des études de toxicologie in vivo pourront être entreprises afin de travailler avec des doses non toxiques.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Du fait de l’induction des modèles, les animaux vont développer une maladie hépatique cholestatique chronique associée à une élévation des enzymes hépatiques et des complications aux long terme telle qu’une hypertension portale et des dommages ou de la fibrose du foie. Cette condition n’est habituellement pas associée à une douleur chez l’homme et n’est donc pas non plus attendue chez l’animal. Aucune complication sévère au long terme, ni autres effets indésirables, ne sont attendus aux doses administrées. Nous n’attendons pas de nuisance liée à l’administration des traitements (doses non toxiques).
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Euthanasie pour récupérer différents organes, dont le foie, pour analyses histologiques ou autre.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’étude de l’efficacité de nouvelles molécules pouvant agir sur l’inflammation et la fibrogenèse implique de disposer de modèles animaux adéquats mimant au mieux la pathologie humaine. Bien que des expériences in vitro seront réalisées en amont, l’espèce rat ou souris à travers nos différents modèles reproduisent au mieux la pathophysiologie des cholestases chroniques hépatiques. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information. Pour vérifier et déterminer l’effet d’un traitement sur l’inflammation et les dommages hépatiques pouvant mener à la fibrose, il est essentiel d’examiner l’animal entier. Il est indispensable car ne peut être reproduit en modèle cellulaire.
2. Réduction
Pour nos expérimentations, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux, pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur l’efficacité du traitement. Le traitement des données entrainera la comparaison de 7 groupes de 6-12 animaux pour chaque étude donc une analyse statistique appropriée sera réalisée avec le test des rangs de Kruskal et Wallis (nonparametric Kruskal-Wallis one-way analysis of variance (Dunn’s post test)). Si deux groupes sont comparés, un test t pour séries non appariés (Mann-Whitney) sera réalisé. Une valeur significative sera considérée si p < 0.05.
3. Raffinement
Toutes les procédures induisant une douleur seront réalisées sous anesthésie (chirurgie, prélèvement de sang) durant toute la procédure expérimentale afin de maitriser et limiter la douleur et la souffrance des animaux. L’anesthésie sera induite par induction à l’isoflurane (et maintien au masque). Les procédures de chirurgie seront effectuées par une personne habilitée et formée. Pour les modèles d’induction par la chirurgie, les animaux recevront un analgésique qui sera administré en phase pré- et post-opératoire ainsi qu’un analgésique local appliqué lors de la procédure chirurgicale. En dehors de la phase de chirurgie, l’utilisation d’analgésiques n’est pas nécessaire pour les modèles inductibles chimiquement étant donné que ce sont des modèles chroniques à long terme et qu’ils ne sont pas supposé induire de douleur notable chez les animaux. Toutefois, en cas de douleur ou de souffrance importante, un analgésique pourra être employé. Nos études étant basées sur des modèles inflammatoires, les anti-inflammatoires ne sont pas applicables. Les animaux seront également sous surveillance rapprochée. Les animaux seront suivis quotidiennement pendant les 10-15 premiers jours qui suivent l’induction puis de façon bi-hebdomadaire ensuite pour pouvoir identifier les signes de souffrance caractérisés par le comportement du rat ou de la souris : les changements physiques (pelage, peau, yeux…), la mobilité, l’alimentation, l’agressivité, le poids du corps (mesuré 2 fois par semaine) limité à une perte de 20% maximum par rapport au poids initial, la consistance des fèces. Nous avons mis en place un tableau de suivi qui permet de définir les points limites adaptés. Si le score total d’un animal, toutes catégories confondues, au cours de l’étude est >7 ou bien si le score dans une seule catégorie est 3, l’animal est euthanasié pour raisons éthiques.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris et le rat sont des modèles d’étude très développés et caractérisés, de par leurs tailles et leurs spécificités. Ce sont des espèces communément utilisées pour les études de cholestases chroniques en accord avec les recommandations internationales et la littérature. Notamment la souche de rat SD est un modèle de laboratoire bien connu avec suffisamment de données historiques. Chez la souris, les souches C57Bl/6, Balb/c et SWISS représentent les souches de choix. Le choix de l’espèce utilisée dépendra en particulier du modèle utilisé, des objectifs et des besoins de l’étude. Si une molécule s’avère efficace dans une espèce, celle-ci pourra être éventuellement testée dans l’autre espèce afin de montrer une efficacité espèces indépendante. Les rats ou souris seront âgés d’au moins 8 semaines au début de l’étude, en accord avec la littérature existante pour effectuer ces différents modèles. De plus, à cet âge, le système immunitaire de ces animaux est totalement développé.