Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 12/04/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-082616)
242 rates vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles inhalent du styrène ou des isomères du xylène six heures par jour, cinq jours par semaine, pendant une à quatre semaines, et une partie subit une chirurgie du crâne pour implanter un système de contention à vis destiné à mesurer les mouvements oculaires, avant la mise à mort et le prélèvement des oreilles. Le porteur indique que les fortes concentrations peuvent déprimer le système nerveux et provoquer des effets narcotiques et des troubles de l’équilibre. Il présente l’étude comme la validation in vivo d’une toxicité déjà suggérée in vitro, en vue d’un éventuel test de criblage des polluants industriels.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Ce projet vise à étudier la potentielle toxicité de quatre solvants aromatiques présents dans l’industrie, le styrène et les trois isomères du xylène, sur l’organe périphérique de l’équilibre, le vestibule, situé dans l’oreille interne. Il s’agit également de comparer cette potentielle toxicité à celle décrite avec ces solvants sur la cochlée, organe périphérique de l’audition, également situé dans l’oreille interne.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
La toxicité vestibulaire de certains solvants aromatiques a été suggérée précédemment par une étude in vitro. La présente étude permettra de valider (ou d’infirmer) ces informations grâce à une approche in vivo. Si les résultats in vivo confirment les résultats obtenus in vitro, alors ce test pourra potentiellement être proposé comme test de criblage afin d’identifier les polluants industriels susceptibles de perturber l’équilibre des salariés.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les animaux seront exposés par inhalation à différentes doses de styrène ou d’un des 3 isomères du xylène. Cette exposition durera entre une et quatre semaines, à raison de 6 heures / jour, 5 jours par semaine. Afin de déterminer les effets de ces différentes substances sur l’oreille interne, l’audition et l’équilibre des animaux seront testées avant exposition, à la fin de l’exposition puis 4 semaines après. L’audition sera estimée par la mesure des produits de distorsion, une méthode non invasive utilisée pour le dépistage des surdités chez les nouveaux nés. Chez le rat, elle nécessite une anesthésie médicamenteuse légère. L’équilibre sera estimé par des tests comportementaux et par la mesure de la persistance des saccades oculaires après rotation (nystagmus post-rotatoire). Cette dernière mesure demande une contention de la tête, qui nécessite l’implantation à demeure d’un système de contention (pas de vis). Cette chirurgie crânienne est réalisée, une seule fois, 4 semaines avant le début de l’exposition. Chez la moitié des animaux, un prélèvement sanguin à la queue sera réalisé sous anesthésie gazeuse en sortie d’exposition. Au terme des expérimentations, les animaux seront mis à mort et les oreilles prélevées pour observer les dommages causés par les expositions aux solvants.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Certains animaux seront opérés afin de recevoir un dispositif de contention pour mesurer les mouvements oculaires. Afin d’éviter les douleurs post-chirurgicales, un antalgique morphinique sera délivré avant de réaliser l’anesthésie. Par ailleurs, il n’est pas exclu, que les animaux recevant une anesthésie par voie générale ou gazeuse, dans le but de réaliser des tests auditifs ou des prélèvements sanguins, ressentent du stress. Néanmoins, celui-ci devrait être mineur car les animaux sont habitués à être manipulés et les gestes sont opérés par du personnel qualifié. Les tests comportementaux, mais également la mise en rotation des animaux lors de la mesure des saccades oculaires, pourraient générer chez les animaux, pendant un court instant, un désagrément se traduisant par des troubles de l’équilibre. Certains animaux seront exposés à des concentrations élevées de solvant 6 heures/jour, 5 jours par semaine durant 4 semaines. Ces concentrations élevées pourront avoir un effet dépresseur sur le système nerveux central et des troubles sensori-moteurs comme des effets narcotiques pourront alors être observés. Néanmoins, ces troubles ne devraient pas persister dans l’heure qui suit la sortie des chambres d’inhalation.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux de la procédure 1 (Evaluation de la fonction vestibulaire par la mesure du nystagmus post-rotatoire chez des rates exposées par voie inhalatoire aux solvants) seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements et l’histologie des tissus biologiques. Tous les animaux de la procédure 2 (Evaluations des fonctions vestibulaire et auditive des rates exposées par voie inhalatoire aux solvants par l’utilisation de tests comportementaux et par la mesure des produits de distorsions acoustique) seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements et l’histologie des tissus biologiques.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
La toxicité de certains solvants industriels sur la cochlée a été démontrée par de nombreuses études sur l’animal et par des approches épidémiologiques en entreprise. En revanche, les effets de ces substances sur le vestibule (récepteur de l’équilibre), qui se trouve également dans l’oreille interne, n’ont jamais été étudiés in vivo. Il est à noter, cependant, qu’un modèle de culture de l’organe récepteur, développé au laboratoire, a suggéré une toxicité de ces solvants sur le vestibule. Ces données in vitro doivent être confirmées par une étude in vivo avant d’alerter les services de santé au travail de la dangerosité de ces subtances sur cet organe. La présente étude se propose d’exposer des rates au styrène et aux différents isomères du xylène par inhalation. L’évaluation de la toxicité se fera par des mesures fonctionnelles, comportementales et histologiques qui permettront de comparer de manière objective les effets toxiques sur la cochlée et sur le vestibule. Des analyses histologiques seront également réalisées post mortem. Cette étude évalue donc la fonction de deux systèmes sensoriels ainsi que diverses réponses réflexes. Ces méthodes ne peuvent être appliquées que sur des organismes vivants. D’autre part, pour modéliser la toxicité de ces agents chimiques chez l’Homme, il est nécessaire qu’ils soient métabolisés par des organismes vivants
2. Réduction
La démarche consiste à tester dans une première phase expérimentale (phase 1) les effets vestibulaires d’une forte concentration de styrène pendant une exposition courte (5 jours). Si celle-ci ne génère pas d’effet vestibulaire, une nouvelle exposition à la même concentration sera réalisée pendant 4 semaines (phase 2). Si aucune vestibulotoxicité n’est observée, la recherche de seuil d’effet (phase 3) ne sera bien évidemment pas réalisée, et les expérimentations seront stoppées. Dans le cas contraire, la phase expérimentale 3 sera menée en exposant les animaux à des concentrations de styrène plus faibles (la durée dépendra des résultats des phases 1 et 2). Enfin, la phase 4 s’attachera à évaluer la vestibulotoxicité de chacun des isomères du xylène (la durée de l’exposition dépendra une nouvelle fois des résultats des phases 1 et 2). Le dispositif crânien des rates destinées aux mesures des saccades oculaires après rotation ne permettant pas les mesures des produits de distorsion acoustique, des lots de rates dédiés spécifiquement à ces tests seront prévus. Ainsi pour chaque solvant et concentration, 2 groupes expérimentaux seront prévus, l’un pour la mesure des saccades oculaires après rotation et l’autre pour les mesures de comportement suivies des mesures des produits de distorsion acoustique (idem pour les contrôles). Lors de chaque campagne, un maximum de conditions expérimentales seront testées simultanément afin de limiter le nombre de groupes contrôles associés. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé par un calcul de puissance (logiciel G-Power). Le résultat de ce calcul est de 10 animaux par groupe. 22 animaux surnuméraires (soit 10% de l’effectif prévu) seront nécessaires en cas de mortalités (anesthésie, perte de casques…). L’étude nécessitera au maximum 242 rates (dont les 22 surnuméraires). Ce nombre pourrait être réduit si les résultats des phases 1 et 2 sont négatifs.
3. Raffinement
Dès leur arrivée à l’animalerie, les rates seront placées dans les conditions standard d’hébergement pour cette espèce (température, hygrométrie). Aucune expérimentation ne sera réalisée lors de la première semaine afin de laisser le temps aux rates de s’habituer à leur nouvel environnement. Par ailleurs, les rates, animaux nocturnes, seront placées en cycle inversé jour-nuit de 12h / 12 h afin de réaliser les expérimentations pendant leur phase d’activité. Elles seront stabulées à 2 ou 3 par cage pour permettre les liens sociaux de s’établir. Les animaux seront habitués à être manipulés en amont des expérimentations. Les animaux soumis à une intervention chirurgicale recevront une médication adaptée à savoir une analgésie pré-opératoire avant de réaliser l’anesthésie et des anti-inflammatoires seront administrés en post-opératoire. Après l’intervention chirurgicale, les animaux seront surveillés et pesés quotidiennement afin de détecter des signes de souffrance ou une perte de poids trop importante nécessitant une prise de décision immédiate. Ils seront hébergés en cage individuelle pendant deux semaines afin d’assurer une bonne cicatrisation. L’utilisation de cages ouvertes et transparentes leur permettra de créer des liens sociaux et des contacts visuels, olfactifs et auditifs nécessaires à leur bien-être. La litière utilisée sera constituée de carrés de cellulose et leur environnement sera enrichi par des tunnels en carton ou du « sizzle nest » pour constituer des nids. Pendant les phases d’exposition par inhalation aux solvants, les rates seront également surveillées toutes les deux heures afin de déceler d’éventuels signes cliniques traduisant un mal-être de l’animal qui nécessiterait d’isoler immédiatement l’animal. Des fiches de suivi seront renseignées à cet effet.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le rat est une espèce couramment utilisée dans les études de toxicologie et, est un modèle recommandé pour les essais in vivo de toxicité des produits chimiques. Par ailleurs, le métabolisme des solvants par le rat est proche de celui de l’Homme. De plus, les expérimentations doivent être menées sur des souches de rat pigmentées comme les rats Long Evans puisque la mélanine est présente au niveau de l’oreille interne, comme chez l’Homme. Les souches albinos sont dépourvues de mélanine ce qui les rend plus sensibles aux solvants. Par ailleurs, la plupart des études expérimentales portant sur les systèmes sensoriels de l’audition et de l’équilibre ainsi que les études comportementales ont été menées avec cette souche de rat ce qui facilitera la comparaison avec nos résultats obtenus au sein du laboratoire. Des femelles ont été choisies pour réaliser les expérimentations car celles-ci grossissent moins avec l’âge que les rats mâles et le dispositif pour enregistrer le mouvement oculaire après mise en rotation de l’animal ne permet pas de faire ces mesures sur des animaux de plus de 300 g. Les rates seront utilisées, pour les mesures fonctionnelles, à l’âge adulte entre 16 et 18 semaines car l’oreille interne ainsi que les enzymes intervenant dans le métabolisme des toxiques doivent être matures.