Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 13/01/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-095330)
Soumises à une ou deux injections intraveineuses de nanoparticules lipidiques ou de vecteurs de thérapie génique sous anesthésie gazeuse, 160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère, toutes tuées à l’issue. Une partie d’entre elles passe un test de force où la queue est reliée à un capteur qui enregistre leurs réponses d’échappement pendant cinq minutes. Le projet vise à valider l’effet de ces nanoparticules contre la fibrose musculaire dans des myopathies génétiques comme la dystrophie de Duchenne, et le porteur écrit qu’un essai clinique concluant « devrait » alors permettre de stopper la progression de la maladie chez les patients. Sur le remplacement, il affirme qu’il n’existe « pas de modèle in vitro de fibrose musculaire » et que l’élimination des cellules fibrotiques par les lymphocytes T exige un milieu physiologique complet.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Notre laboratoire cherche à traiter un certain type de myopathies (maladie des muscles) qui comprennent en particulier la dystrophie musculaire de Duchenne et les dystrophies musculaires des ceintures. Ces myopathies sont des maladies génétiques rares, progressivement invalidantes et conduisent à la perte de la marche. Le muscle sans ses protéines structurales finit par se détruire puis l’apparition de la fibrose rigidifie le tissu et entraîne de sévères complications. Dans la myopathie de Duchenne, la protéine déficiente s’appelle la dystrophine. Cette protéine joue un rôle d’amortisseur au cours des cycles de contraction/relaxation du muscle et un rôle fonctionnel dans la membrane musculaire. Aucun traitement curatif n’est actuellement disponible. Les stratégies visant à ajouter une copie fonctionnelle du gène et/ou à réduire la fibrose constituent l’approche la plus prometteuse pour le traitement de ces myopathies. Des approches de thérapie génique sont en cours d’étude et consistent à introduire un gène médicament dans l’organisme du patient à l’aide d’un vecteur viral inoffensif pour remplacer le gène malade et rétablir le fonctionnement de la protéine. Néanmoins, les tests cliniques utilisant l’administration de versions courtes de la protéine dystrophine (micro-Dystrophine) via un virus adéno-associé (AAV), ont mis en évidence seulement une efficacité partielle du traitement et ont révélé des risques pour la sécurité des patients, tels qu’une réponse immunitaire associée à la dose élevée d’AAV utilisée. C’est pourquoi, dans ce projet, nous souhaitons explorer la technologie des nanoparticules, utilisées dans la formulation de certains vaccins, pour délivrer les ARN messagers de gènes thérapeutiques et réduire la fibrose dans le tissu musculaire. Ces nanoparticules sont le plus souvent lipidiques et permettent un transfert efficace et ciblé de protéine ou d’acide nucléique dans les cellules d’intérêts. Nous souhaitons donc tester dans un premier temps l’immunogénicité de ces particules chez la souris et dans un second temps, tester l’efficacité des nanoparticules pour le transfert de gènes et pour la reprogrammation de cellules T en cellules T anti-fibrose. L’étude permettra en outre de tester l’efficacité thérapeutique de grandes versions de dystrophine ou de dystrophine complète pouvant être logées dans les nanoparticules, ce qui ne pourrait pas être possible dans les AAV étant donné leur capacité de cargo limitée.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet se place dans le cadre de la recherche de traitements pour des maladies génétiques humaines touchant le muscle squelettique. Il vise à valider l’effet thérapeutique de nanoparticules lipidiques pour un groupe de maladies humaines sur un modèle murin de la maladie. L’observation d’un effet thérapeutique pourrait permettre d’envisager un essai clinique qui, s’il est probant, devrait permettre de stopper l’évolution de la pathologie chez les patients atteints de dystrophie, et donc de valider une thérapie pour des maladies qui n’en n’ont pas à ce jour.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les animaux seront soumis à des prélèvements de sang sous anesthésie gazeuse d’une durée maximum de 5 minutes pour vérifier la présence des nanoparticules lipidiques et analyser la réponse immunitaire. Ils seront aussi soumis à l’injection de nanoparticules lipidiques et ou de vecteurs de thérapie génique en intraveineux sous anesthésie gazeuse. Pour la PE1, il y aura 2 prélévements de sangs et une seule injection de nanoparticules lipdiques. Pour la PE2, les souris auront un prélévements de sang et deux injections en intraveineux, soit deux injections de nanoparticules lipidiques à deux semaines d’intervalle, soit une injection de nanoparticules lipidiques et 15 jours après une injection de vecteurs de thérapie génique. La durée d’anesthésie et le temps de d’injection durent moins de 5 minutes par souris. Pour le test de force musculaire, la queue des animaux est reliée à un capteur de force qui va enregistrer les réponses d’échappements des animaux. Ce test est limité à 5 min et ne peut être réalisé qu’une seule fois.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les nuisances (douleur ou stress) attendues sur les animaux sont liées en particulier à la nature des différents actes réalisés. Les nuisances de classe légères sont liées à l’acte d’anesthésie lors de l’injection : du traitement et des prélèvements de sang. Il y a une possibilité de sécheresse oculaire au cours des anesthésies. Les nuisances attendues pour le test de force sont de classe legère. Cet acte ne sera fait qu’une fois. En ce qui concerne le modèle utilisé, même s’ils portent une anomalie génétique correspondant à une dystrophie musculaire chez l’homme, ils présentent un phénotype moins important que les patients.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les animaux de chaque procédure seront tous euthanasiés pour collecter les muscles squelettiques, la rate et les ganglions pour analyser au laboratoire les effets de nos traitements.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Nous réalisons systématiquement des tests préalables in vitro pour exclure les nanoparticules de mauvaise qualité. Nous vérifions la présence de l’ARN messager du gène d’intérêt après infection cellulaire en mesurant l’expression des protéines d’intérêts. Afin de valider l’effet des nanoparticules anti-fibrose sur la fibrose in vivo au préalable à une application chez l’homme, nous souhaitons utiliser un modèle animal (souris), car aucun modèle in vitro n’est capable de développer cet aspect de la pathologie. En effet, il n’existe pas de modèle in vitro de fibrose musculaire et l’interaction et l’élimination des cellules fibrotiques par les lymphocytes T nécessite un milieu physiologique où la réponse immunitaire peut avoir lieu.
2. Réduction
Au cours des 5 années du projet, nous avons prévu d’utiliser un total de 160 souris pour faire l’ensemble des expériences in vivo. Ce projet se limite aux expériences considérées comme absolument indispensables et prévoit l’exploitation maximale des données obtenues. Lorsque ce sera possible, nous utiliserons les mêmes souris contrôles pour des expériences différentes en tant que contrôle pour les différents modèles évalués. De plus, un maximum d’analyses sera réalisé sur organes prélevés après la mort des animaux pour éviter des doublons de procédures expérimentales. Nous administrerons les nanoparticules lipidiques par voie sanguine car c’est le moyen le plus efficace et le moins invasif pour cibler tous les muscles de l’organisme. Le nombre d’animaux utilisés par groupe est optimisé pour obtenir des résultats statistiquement significatifs.
3. Raffinement
Les animaux sont élevés dans un environnement enrichi. Aucun animal n’est seul dans une cage, sauf si problème d’agressivité. Des mesures pour augmenter le confort des animaux sont également appliquées telles l’application de gel oculaire pour éviter le dessèchement des tissus lors des anesthésies. Les prélèvements de sang à la veine submandibulaire se font sous anesthésie de courte durée. Les doses de nanoparticules injectées sont faibles par injection et d’après les données de la littérature scientifique aucune toxicité n’est attendue. Néanmoins une surveillance de l’état général des animaux sera effectuée régulièrement. Nous appliquons les points limites établis préalablement et utilisons les procédures d’euthanasies appropriées.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Ce projet se place dans le cadre de la recherche de traitements pour des maladies génétiques humaines touchant le muscle squelettique. Les modèles murins inclus dans ce projet portent des anomalies génétiques ciblant le gène de la pathologie chez l’homme qui va entraîner le plus souvent des désordres musculaires sans impact sur l’activité naturelle de la souris. Ces modèles permettent d’analyser les perturbations de la fonction musculaire et sont donc pertinents pour nos études. Nous utiliserons pour ce projet des souris jeunes d’environ 2 mois- 3 mois car c’est à cet âge que les muscles sont les plus permissifs au traitement de thérapie génique. Le développement de la fibrose qui est un frein majeur au transfert de gène musculaire est progressif et la cinétique de dépôts de collagène varie d’un muscle à l’autre. Nous avons vu également dans nos précédents résultats que pour réduire la fibrose de manière significative dans le muscle via des cellules T anti-fibrose, il faut cibler et éliminer le plus tôt possible les cellules fibroblastiques sécrétrices de collagène, soit environ à l’âge de 2 mois.