Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 19/10/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-096080)
312 rats vont être utilisés, tous tués à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Seuls des mâles sont retenus, recevant chaque jour pendant six semaines un antidépresseur ou du tramadol par micropipette, puis passant des tests comportementaux nommés, piscine de Morris, actimétrie et reconnaissance d’objet, avant une mise à mort par overdose d’anesthésique et décapitation pour prélever le cerveau. Le porteur décrit les troubles cognitifs recherchés, sédation, confusion et pertes de mémoire, comme l’objet même de l’étude. Il affirme qu’aucune approche in vitro ou in silico ne reproduit la « complexité de notre organisme » et justifie le rat par son « large répertoire comportemental » et son volume sanguin.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’objectif de cette étude est d’évaluer l’impact de l’administration chronique de médicaments psychoactifs sur la cognition et l’équilibre chez le rat. Nous souhaitons évaluer en particulier l’impact de l’administration chronique des antidépresseurs, largement prescrits chez la personne âgée du fait de la présence de troubles anxiodépressifs dans cette population. Les médicaments ayant une activité anticholinergique, comme certains antidépresseurs, sont un facteur de risque de troubles confusionnels, c’est-à-dire une altération de la vigilance ou des capacités attentionnelles. Cela peut toucher l’ensemble des fonctions cognitives : mémoire, orientation temporo-spatiale… Son incidence est élevée chez les personnes âgées et sa survenue associée à une augmentation de la morbi-mortalité. Cette étude permettra également d’évaluer le lien entre troubles cognitifs et potentiel anticholinergique des antidépresseurs testés. L’objectif de notre étude est donc d’évaluer les effets cognitifs à court et long terme de différents antidépresseurs, appartenant à des classes médicamenteuses différentes et ayant une affinité différente sur les récepteurs muscariniques, dans un modèle rongeur. Les différents effets observés seront comparés selon la population observée (animaux jeunes ou âgés). Dans le but de valider le protocole mis en place, et pour avoir une évaluation la plus sensible possible des troubles cognitifs, nous réaliserons ce même protocole une première fois avec le tramadol. En effet, le tramadol est une substance active connue pour ses effets indésirables négatifs sur la cognition et ses effets sont décrits dans la littérature. Il altère notamment les performances mnésiques. De plus, la méthode d’administration que nous souhaitons utiliser pour l’ensemble de cette étude n’a, à notre connaissance, jamais été utilisée pour le tramadol. Il s’agit de l’administration de substances actives par micropipette (méthode MDA pour Micropipette-guided Drug Administration) à l’aide de lait concentré sucré dilué au 3/10. Le tramadol sera donc utilisé pour valider le protocole mis en place et son utilisation. Ce protocole sera ensuite répété pour les antidépresseurs à tester : duloxétine, citalopram, paroxétine et imipramine. Les effets de ces différentes substances actives sur la cognition des animaux jeunes ou âgés seront évalués et pourront confirmer ou infirmer les effets observés chez l’Homme.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Cette étude permettra d’abord de développer un protocole complet d’étude des troubles cognitifs d’origine iatrogénique chez l’animal. Ce protocole sera ensuite utilisé pour l’identification des médicaments psychoactifs à risque d’entrainer des troubles cognitifs et potentiellement accroître le risque de chute, notamment chez la personne âgée. Ainsi, nous espérons prévenir l’apparition de ces troubles chez la personne âgée et ainsi avoir une action préventive en apportant un conseil quant aux posologies les plus adaptées chez la personne âgée ou des alternatives thérapeutiques lorsqu’il en est possible.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les animaux seront soumis à une administration quotidienne de substance active par micropipette pendant 6 semaines soit un total de 42 administrations. Lors de nos précédents travaux, nous avons mis en évidence que la durée de cette administration est d’une minute environ. Ces administrations seront précédées d’une pesée de chaque animal soit 42 pesées au total (1 minute par pesée).
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Plusieurs tests comportementaux seront réalisés durant l’étude : piscine de Morris, actimétrie, reconnaissance d’objet. Ces tests peuvent entrainer un stress chez les animaux. Concernant les molécules administrées, elles peuvent entrainer des troubles cognitifs chez les animaux, c’est ce que nous cherchons à évaluer. Le tramadol est un antalgique de palier II, pouvant entraîner des troubles digestifs comme une constipation. La duloxétine est un IRSNa pouvant avoir un effet sédatif. La paroxétine et le citalopram sont des ISRS pouvant entrainer des troubles digestifs, une confusion par hyponatrémie, une somnolence. L’imipramine est un antidépresseur tricyclique pouvant entrainer une sédation, une confusion, une constipation.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux de l’étude seront mis à mort à la fin de la procédure. En effet, la récupération de pièces cérébrales conditionne les études électrophysiologiques ex-vivo, sur tranches de cerveau. Par conséquent, ceux-ci seront mis à mort à l’issu du dernier test comportemental. Ces analyses nous permettent d’évaluer si l’administration chronique des différentes substance actives étudiées affecte la plasticité synaptique. Lors de la mise à mort, des prélèvements sanguins seront également réalisés pour un dosage sanguin en substances actives.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Des études in vitro ou in silico ne permettent pas de mettre en évidence l’impact de la consommation chronique de substances actives dans l’apparition de troubles cognitifs et de l’équilibre. Il ne serait pas non plus possible de démontrer les mécanismes mis en jeu dans l’apparition de ces troubles. En effet, ce qui fait la complexité de la compréhension de l’installation des effets indésirables médicamenteux est justement la complexité de notre organisme (système sensoriel, système musculosquelettique, système nerveux etc.). Ce système complexe est modulé en fonction de nombreux facteurs, extrinsèques (liés à l’environnement, mode de vie) comme intrinsèques. Parmi les facteurs intrinsèques, on retrouve la prise de médicaments, qui peut entrainer des modifications physiopathologiques chez les patients. S’ajoute à cela un autre facteur intrinsèque, l’âge, qui va induire, là encore, une variabilité pharmacocinétique et pharmacodynamique. Il est donc nécessaire de réaliser ces tests comportementaux in vivo car il est impossible de prévoir la résultante cognitive à toutes ces contraintes. De plus, nos résultats seront comparés aux données obtenues chez l’Homme lors de nos précédents travaux, il est donc important de travailler chez l’animal pour avoir une meilleure comparabilité, le rongeur ayant un large répertoire comportemental, les résultats seront comparables à ce qui peut être observé chez l’Homme. Pour les enregistrements électrophysiologiques, nous avons besoin de tranches de cerveaux obtenues à partir d’organismes ayant été exposés de façon chronique aux substances actives d’intérêt dans notre projet. La technique utilisée dans notre étude est la MultiElectrode Array (MEA). Celle-ci permet de réaliser des enregistrements extracellulaires et fournit une vue globale du réseau neuronal. Les études électrophysiologiques consisteront en l’enregistrement de potentiels par l’évaluation de la transmission de base et de la potentialisation à long terme dans l’aire CA1 hippocampique (tranche d’hippocampe). Nous avons également besoin d’échantillons sanguins pour réaliser des dosages pharmacocinétiques, ce qui n’est pas possible in vitro ou in silico. Nous avons choisi le modèle rat afin d’avoir un répertoire comportemental plus large et un volume sanguin plus important pour nos prélèvements et ainsi réaliser les dosages nécessaires.
2. Réduction
Le nombre d’animaux prévus dans les expérimentations a été réduit à son strict minimum. Seuls des mâles seront utilisés dans cette étude afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires. Dans la littérature, les mâles représentent la majorité des animaux utilisés dans la recherche sur les rongeurs. Notre méthode d’administration est par voie orale par micropipette en utilisant du lait concentré sucré dilué. Après la puberté, les femelles montrent une nette augmentation de la préférence pour la saccharine, qui est en partie sous contrôle hormonal. Après la maturation, les mâles préfèrent une solution de glucose, tandis que les femelles préfèrent une solution de saccharine. Les femelles préfèrent également des concentrations plus élevées de saccharine que les mâles. Le lait concentré sucré contient du sucre de betterave et du sucre de canne, qui sont tous deux des saccharoses. Si les rats mâles sont suffisamment motivés pour prendre la micropipette, les femelles le seront encore plus. Des groupes de 12 rats mâles seront formés afin d’avoir une puissance statistique suffisante. De plus, en utilisant des rats (et non des souris), nous pouvons réduire le nombre d’animaux utilisés car le rat possède un volume sanguin plus important que celui de la souris et nous permet donc de pouvoir effectuer tous les dosages sanguins en un seul prélèvement. Tous les animaux utilisés pour les études comportementales seront également utilisés pour les études post-mortem ce qui permet de réduire considérablement le nombre d’animaux.
3. Raffinement
Diverses mesures seront prises pour raffiner les expérimentations qui ne seront réalisées que par du personnel formé et ayant un livret de compétences à jour. Les animaux seront hébergés par deux tout au long de l’expérimentation dans des cages standards, répondant aux normes d’éthique. La stabilité des groupes permettra de réduire une éventuelle agressivité. Les animaux seront maintenus dans des conditions contrôlées d’hébergement, c’est-à-dire dans un environnement stabilisé en température, hygrométrie, luminosité et en cycle normal. Après leur arrivée au laboratoire, les animaux ne seront pas manipulés (hormis la surveillance quotidienne et le change de cage bi-hebdomadaire) pendant 1 semaine afin de les laisser s’acclimater à leur nouvel environnement. La semaine suivante, les animaux seront habitués à leur expérimentateur, pendant 5 min par jour, afin de réduire le stress lié aux manipulations. Lors des tests comportementaux, les rats seront placés dans la pièce expérimentale 1h avant le début des tests pour s’acclimater à la pièce. Leur environnement est enrichi avec des lamelles de papier kraft et un rouleau de carton afin d’assurer un enrichissement minimum, permettant aux animaux de trouver un abri en cas de conflit et d’avoir une activité minimale (construction de nid). L’eau sera fournie ad libitum et l’apport en nourriture sera contrôlé. Leur poids sera mesuré tous les jours et un responsable des animaux vérifiera leur apparence physique externe (poils hérissé, chromodacryorrhée…) ou des changements de comportement (attitude de prostration, animal ne répondant plus à son environnement ou réagissant de manière inhabituelle à l’expérimentateur, réduction importante de l’activité motrice…). Un animal présentant un tel état de mal-être ou de souffrance sera immédiatement exclu de l’étude et une discussion sera entreprise avec des membres de la SBEA concernant son éventuelle mise à mort sous anesthésie et analgésie si jugé nécessaire (cf grille de points limites). Lors de la mise à mort des animaux, une overdose d’anesthésique sera réalisée sous isoflurane suivie d’une décapitation pour récupération des cerveaux.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
L’espèce choisie est la rat (Rattus norvegicus), il s’agit avec la souris, d’espèces très utilisées en recherche pré-clinique. Le rat est une espèce facile à maintenir, en termes de coût et de place, son comportement est bien connu et détaillé dans la littérature et sa proximité génétique avec l’espèce humaine permet d’accéder à des mécanismes cérébraux communs et à des fonctions cognitives et des comportements en beaucoup de points similaires et mesurables (anxiété, mémoire, locomotion). Du fait de sa taille supérieure, le rat possède un plus grand volume sanguin que la souris et permet donc d’augmenter le nombre d’analyses sanguines réalisées tout en réduisant le nombre d’animaux utilisés Pour les expérimentations sur rats jeunes, des rats âgés de 6 semaines seront utilisés. Ils auront plus de 4 mois pour l’étude de la plasticité synaptique hippocampique par électrophysiologie, leur croissance et développement cérébral seront atteints. Pour les expérimentations sur rats âgés, des rats âgés de 22 semaines seront utilisés. Ce groupe permettra de réaliser une comparaison avec le groupe de rats jeunes.